[发明专利]一种东毕吸虫病检测用虫卵抗原的制备及ELISA检测试剂盒

说明书

本发明涉及一种东毕吸虫病检测用虫卵抗原的制备及ELISA检测试剂盒。本发明建立的东毕吸虫病间接ELISA检测方法，所述试剂盒中包括：东毕吸虫虫卵抗原、封闭液（5%脱脂奶粉），酶标二抗（HRP标记的兔抗羊Ig G），PBST，显色液（TMB底物液）、终止液（2 mol/L硫酸）。所需要的抗原浓度为0.5μg/ml，血清稀释度为1:100。本申请的方法具有灵敏度高、准确性和稳定性好等优点。

技术领域

本发明涉及蛋白纯化和检测技术领域，具体涉及利用东毕吸虫虫卵抗原制备的血吸虫ELISA试剂盒及其应用。

背景技术

东毕吸虫病是由东毕吸虫寄生于宿主的门静脉和肠系膜静脉引起的一种血吸虫病。东毕吸虫细分为彭式东毕吸虫、程式东毕吸虫、土耳其斯坦东毕吸虫和土耳其斯坦东毕吸虫结节变种。东毕吸虫发育过程需要经过两个宿主：终宿主和中间宿主。东毕吸虫尾蚴钻入终宿主牛、羊等家畜皮肤后，经过移行，最终发育成合抱的成虫，并在宿主血管内产卵；虫卵由血管进入肠道，随着粪便排出体外，在水体中孵化出毛蚴；毛蚴进入中间宿主耳萝卜螺体内进行无性繁殖，产生大量的尾蚴；成熟的尾蚴释放到水中，遇到适宜宿主即可钻入宿主皮肤，完成东毕吸虫的生活史循环。

家畜一旦感染东毕吸虫，由于东毕吸虫幼虫在体内移行，常造成宿主组织的机械性损伤；在成虫期和产卵过程中不仅争夺营养物质还产生毒素，影响牲畜的正常身体机能。羔羊表现严重营养不良，食欲不振，精神萎靡，发育滞缓，下肢水肿无力，排出稀便或血便，逐渐消瘦最终倒地不起；母羊还会不孕或流产、死胎。家畜东毕吸虫病不仅严重损害牧民的经济利益，而且尾蚴也能感染人类，产生尾蚴性皮炎，危害人类的身体健康，因此，东毕吸虫病是一种重要的人畜共患寄生虫病。

在与东毕吸虫亲缘关系较近的日本血吸虫病诊断中，IHA和ELISA与孵化法和Kato-Katz粪检阳性符合率较高，敏感性明显高于粪便检查，且操作方便，适合现场筛选。且ELISA诊断方法较粪检法和毛蚴孵化法具有检出率高，人为因素少，结果客观，适合大规模检测的特点。日本血吸虫ELISA诊断中，以虫卵可溶性抗原作为诊断抗原的灵敏性和特异性均优于成虫可溶性抗原以及多种表达的单一重组抗原。但由于东毕吸虫产卵量低，很难获得足够的虫卵。合抱的成熟雌性虫体只含一个虫卵，这和日本血吸虫一对成虫一天排出1000-2000个虫卵的产卵量不可同日而语；而且由于东毕吸虫产卵量少，虫卵造成的器官病变不像日本血吸虫病明显，人们往往很难判断虫卵的主要沉积部位，更无从下手收集虫卵。同时，东毕吸虫产卵量低且虫卵主要集中分布在宿主的肠壁组织，尤其是十二指肠和小肠肠壁，肠壁的肌肉和结蹄组织多，匀浆不易破碎，利用纯化日本血吸虫虫卵的过筛法纯化虫卵，肌肉和结蹄组织极易堵塞筛孔；肠壁的粘膜层具有一定的粘性，也不易过筛。因此一般使用东毕吸虫成虫可溶性抗原，或这些抗原的组分或基因工程表达重组蛋白作为诊断抗原。以东毕吸虫虫卵抗原作为诊断抗原目前尚未报道。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种东毕吸虫虫卵及虫卵抗原纯化方法、相关的纯化抗原和血吸虫抗体检测ELISA试剂盒。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种东毕吸虫虫卵可溶性抗原的提取方法。

东毕吸虫虫卵置于研磨器中，按照1:1-5的体积比加入生理盐水，研磨器内粉碎，镜检无完整虫卵；-40℃至10℃反复冻融3次，冰上超声，超声2秒间隔9秒，共0.5-2小时，超声后12000r/min离心5分钟，取可溶性上清，即为虫卵可溶性抗原粗提物，-20℃冻存。生产前，将虫卵可溶性抗原再次12000r/min离心5分钟，上清BCA法测蛋白浓度。

进一步的，本发明提供了一种东毕吸虫虫卵纯化抗原，其特点是，采用上述的东毕吸虫虫卵粗抗原纯化方法制备而成。

进一步的，本发明提供了一种东毕吸虫抗体ELISA试剂盒；

优选的，所述以虫卵可溶性抗原作为检测抗原的诊断东毕吸虫病间接ELISA操作方法：