[发明专利]一种细胞表面标记特异性富集的人牙髓干细胞微胶囊及其制备方法

说明书

本发明主要涉及一种细胞表面标记特异性富集的人牙髓干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。发明还涉及其制备方法、生物学效力检测方法。本发明也涉及将通过本发明制备的细胞微胶囊用于再生医学的用途。

技术领域

本发明主要涉及一种细胞表面标记特异性富集的人牙髓干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。发明还涉及其制备方法、生物学效力检测方法。本发明也涉及将通过本发明制备的细胞微胶囊用于再生医学的用途。

背景技术

间充质干细胞是一类具有自我复制能力和多向分化潜能的多能干细胞，在机体的发育及发育成熟后组织器官稳态（Homeostasis）维持过程中起重要作用。它的这种特性使它成为再生医学理想的种子细胞，可用于多种组织器官的损伤修复。

在修复过程中，植入干细胞长期存活并维持生物学特性是保证其疗效的关键。尽管间充质干细胞免疫原性低，且具有免疫调节活性，但动物实验结果显示，移植的间充质干细胞并不能保持长期存活。

为了解决这一问题，可将干细胞经生物材料包裹，制成微胶囊。当移植入体内时，干细胞可在空间上和机体的免疫细胞及炎性环境保持隔离。同时，氧气、营养物质和代谢废物可通过具有半透膜特性的生物材料进行有效交换。这样，在不使用免疫抑制剂的前提下，植入的干细胞可长期存活并发挥功能。

所述的生物材料选自天然高分子材料，胶原，藻酸盐，壳聚糖，透明质酸中的一种或多种。

藻酸盐是海藻酸的盐类。海藻酸是从海带中提取的一种多聚糖醛酸，不溶于水，但其钠盐易溶于水。藻酸盐溶液通过和二价阳离子，如Ca²⁺交联可形成凝胶。藻酸盐凝胶无毒，注入体内后不会引起免疫反应，但缺点是孔隙大和不稳定。

壳聚糖是几丁质的衍生物，可与京尼平发生共价交联，交联后具有无毒、生物相容性好、抗炎等特点。

在藻酸盐凝胶外包裹一层壳聚糖膜，共价交联的壳聚糖膜可提供更好的稳定性。稳定的微胶囊可以延长细胞在体内的停留时间，提高其有效性。

微胶囊的大小对包裹其中的细胞活率有较大影响。微胶囊的直径太大(>500μm)，营养物和氧气向微胶囊中心的细胞扩散不足，代谢废物不能及时排出，会导致细胞活率下降。微流体技术可以制备出粒径分布均匀，且直径小于500μm的微胶囊。

牙髓干细胞是间充质干细胞的一种，而通过细胞表面标记特异性富集的亚群，优选CD18⁺牙髓干细胞亚群有更强的克隆形成能力，更优的成骨分化能力，具有优越的科研和临床应用前景。

发明内容

本发明提供了一种细胞表面标记特异性富集的人牙髓干细胞微胶囊及其制备方法，所述微胶囊包括微球内核及外壳。具体地说，是通过如下技术方案实现的：

本方法采用了含有多种消化酶的组合来消化成人牙髓组织，获得单个细胞悬液。包括但不限于胶原酶、分散酶、透明质酸酶、胰酶、EDTA等，这些消化酶组合可大大提高细胞的得率。

本方法中胶原酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。分散酶的使用浓度可以是1 mg/ml，2mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml。

本方法是通过细胞表面标记特异性富集，优选CD18来富集牙髓干细胞亚群，CD18可以使用荧光标记，或磁珠标记。相应的，精确的细胞分离技术包括流式细胞仪分选，或免疫磁珠分选。