[发明专利]一种限制性内切酶SmaI及其表达纯化方法

权利要求书

1.一种限制性内切酶SmaI的表达纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

构建含有限制性内切酶SmaI表达片段的重组工程菌，诱导培养，裂解菌体，纯化回收产物，即得限制性内切酶SmaI；

所述纯化的方式包括Ni离子亲和层析、阴离子交换层析或肝素亲和层析中的至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的表达纯化方法，其特征在于，所述重组工程菌的构建方法包括将限制性内切酶SmaI基因片段连接表达载体pG-28b，得到限制性内切酶SmaI重组表达载体pG-28b-SmaI，再将重组表达载体转入工程菌中；

优选地，所述工程菌包括大肠杆菌，优选为大肠杆菌ER2566；

优选地，所述限制性内切酶SmaI基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的表达纯化方法，其特征在于，所述诱导的诱导剂包括IPTG；

优选地，所述诱导剂的终浓度为0.3-1mmol/L，优选为0.5mmol/L；

优选地，所述诱导培养的温度为35-40℃，优选为37℃；

优选地，所述诱导培养的转速为180-220rpm，优选为200rpm；

优选地，所述诱导培养的时间为14-16h。

4.根据权利要求1-3任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述裂解菌体包括以下步骤：诱导培养后收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，得重悬液，加入蛋白酶抑制剂，超声破碎，离心取上清得含有目的蛋白的裂解液；

优选地，所述裂解缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、300mmol/L的NaCl和5mmol/L的咪唑；

优选地，所述裂解缓冲液与菌体的体积质量比为(2-10):1mL/g，优选为10mL/g。

5.根据权利要求1-4任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为AEBSF；

优选地，所述蛋白酶抑制剂的终浓度为1.0-1.5μg/ml，优选为1.25μg/ml；

优选地，所述超声的压强为80-90MPa，优选为85MPa；

优选地，所述超声的时间为2-3min，优选为2.5min。

6.根据权利要求1-5任一项所述的表达纯化方法，其特征在于，所述纯化的方式为将裂解液依次进行Ni离子亲和层析、阴离子交换层析和肝素亲和层析；

优选地，所述Ni离子亲和层析包括以下步骤：用裂解缓冲液平衡基质，然后经过浓度梯度的咪唑洗脱液洗涤，收集含有目的蛋白的洗脱液1；

优选地，所述浓度梯度的咪唑洗脱液中的咪唑终浓度为20-250mmol/L。

7.根据权利要求6所述的表达纯化方法，其特征在于，所述阴离子交换层析包括以下步骤：将经过Ni离子亲和层析收集的含有目的蛋白的洗脱液1用低盐缓冲液稀释，用平衡缓冲液平衡阴离子交换柱，再用NaCl溶液进行线性洗脱，收集含有目的蛋白的洗脱液2；

优选地，所述低盐缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris，1mmol/L的DTT和0.1mmol/L的EDTA；

优选地，所述稀释的倍数为3-4倍；

优选地，所述平衡缓冲液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L的NaCl；

优选地，所述NaCl溶液包括终浓度10mmol/L的Tris、1mmol/L的DTT、0.1mmol/L的EDTA和50mmol/L～1mol/L的NaCl；

优选地，所述洗脱的线性流速为60cm/h-90cm/h，优选为75cm/h。