[发明专利]定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法，旨在解决诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等技术问题。该小分子组合物含尼克酰胺5～50ng/ml、姜黄素0.5～10μM，余量成分为水。视网膜色素上皮细胞的制备方法：将hESCs集落融合至60%～70%时去除培养液内的bFGF；培养直至形成色素细胞，再色素细胞移至铺有基质胶的培养皿，换为视网膜色素上皮细胞培养基；诱导分化培养的第1～10天加尼克酰胺；诱导分化培养的第11天起，加小分子组合物继续培养至第30天，即得。本发明能够获得高纯度的视网膜色素上皮细胞，为治疗视网膜变性疾病提供质量可靠的治疗细胞。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法。

背景技术

我国是盲人最多的国家之一，最常见的致盲性疾病包括视网膜变性、青光眼、白内障、角膜病变等，而视网膜变性的发生率超过致盲性眼病的三分之一。我国视网膜病变患者已超过5000万，每年因此类疾病失明的患者近20万，是目前国际上尚无有效治疗手段的严重致盲性眼病。视网膜变性疾病主要表现为视网膜色素上皮细胞（RPE）受损变性或萎缩。PRE是位于视网膜与脉络膜之间的一种单层细胞，对于维持视网膜及其光受体细胞的正常功能起着关键的作用。RPE功能失调、变性或缺失会引起视网膜功能的减退导致盲目，目前国内外尚无逆转这种退行性过程并恢复视力的有效方法。

前人曾尝试有多种替代受损RPE的方法，如直接注射自体RPE细胞到视网膜下腔，RPE组织移植，移植胚胎视网膜组织和RPE到视网膜下腔等。新近研究中，Schwartz等开展的把人胚胎干细胞（hESCs）分化而来的RPE注入失明患者的视网膜下腔的临床实验显示，病人未产生排斥反应，同时视力有所改善。细胞替代疗法是目前治疗视网膜变性疾病的可行性途径之一。

既往研究认为，胚胎干细胞具有体外无限增殖能力和多向分化潜能，将其诱导成为RPE细胞后，移植入损伤或萎缩的视网膜下腔，治疗视网膜变性疾病，受到广泛的关注。然而，诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞大多存在诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等问题，故而难以获得足量的治疗及细胞，成为限制细胞替代疗法临床应用的瓶颈之一。

因此，亟需研发一种稳定、安全、高效的将hESCs诱导分化为RPE的方法，以提高诱导分化RPE的效率，为RPE的临床应用打下基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种定向诱导细胞分化的小分子组合物及视网膜色素上皮细胞的制备方法。该小分子组合物可诱导人胚胎干细胞定向分化为视网膜色素上皮细胞，以期解决现有技术诱导分化效率低、分化周期长、成本费用高等技术问题，从而获得高纯度的视网膜色素上皮细胞，为治疗视网膜变性疾病提供质量可靠的治疗细胞。本发明所使用的所有人胚胎干细胞都是可商购的。

为解决上述技术问题，本发明采用的具体技术方案如下：

筛选得到一种定向诱导细胞分化的小分子组合物，含尼克酰胺5～50ng/ml、姜黄素0.5～10μM（μmol/L），溶剂为去离子水或蒸馏水。

所述尼克酰胺的优选浓度为10ng/mL。

所述姜黄素的优选浓度为1μM。

提供一种视网膜色素上皮细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）将人胚胎干细胞活化培养并传代，集落融合至60%～70%时去除培养液内的bFGF，且每隔1～3天换培养液一次，直至培养形成色素团/色素灶（由细胞自然分泌的色素成分形成）后，再将色素团/色素灶移至铺有基质胶的培养皿，添加视网膜色素上皮细胞培养基进行诱导分化培养；

（2）在诱导分化培养的第1～10天内向培养基中加入尼克酰胺，使其在培养基中的浓度为5～50ng/ml，且每隔1～3天换一次培养基；