[发明专利]一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取及检测分析方法

权利要求书

1.一种石蜡包埋样本中蛋白质的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)去石蜡：去除石蜡包埋样本中的石蜡；

2)冷冻干燥：将去除石蜡的样本进行冷冻干燥至完全干燥；

3)裂解：先液氮研磨再加入裂解液最后采用冰浴超声破碎；其中，裂解液包括0.1MTris-HCl、0.1M二硫苏糖醇、1mM苯甲基磺酰氟、2mM EDTA，pH为8.0；超声破碎的条件为：超声破碎2秒，间歇时间为3秒，功率为150-250W，超声裂解的时间为10-20min；

4)加热：向裂解后的样品中加入终浓度为4％的SDS混匀，95-105℃金属浴震荡80-100min，冷却至室温；

5)离心：取上清；

6)丙酮沉淀：加入3-5倍体积的冷丙酮，再加入30mM二硫苏糖醇,混匀后，-20℃静置沉淀；

7)离心复溶：离心取上清，沉淀风干后加入含有8M尿素、0.1M四乙基溴化铵的溶液进行溶解；

8)还原：加入0.5-1.5％体积比的1M二硫苏糖醇，50-70℃水浴25-40min；

9)烷基化：加入8-12％体积比的0.55M碘代乙酰胺，常温暗室静置25-35min；

10)二次丙酮沉淀：加入3-5倍体积的冷丙酮，同时加入10mM二硫苏糖醇，混匀，-20℃静置沉淀；

11)离心：离心去上清，沉淀即为提取得到的蛋白质。

2.一种石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，按照权利要求1所述的方法提取石蜡包埋样本中的蛋白质，对提取得到的蛋白质依次进行复溶、酶解和脱盐处理，经过脱盐处理后的样品进行HPLC分组分、质谱检测和数据分析。

3.根据权利要求2所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，酶解包括以下步骤：取复溶后的蛋白质溶液，依次加入四乙基溴化铵、CaCl₂溶液、胰酶，震荡混匀离心，37℃水浴过夜。

4.根据权利要求2所述的石蜡包埋样本中蛋白质的检测分析方法，其特征在于，脱盐处理包括以下步骤：

1)将水浴过夜后的样本离心取上清，加入甲酸酸化，震荡混匀后离心取上清备用；

2)采用甲醇和甲酸活化和酸化C18柱料；

3)将酸化后的样品加入步骤2)中的柱料中缓慢旋转反应；

4)用甲酸和乙腈溶液清洗，离心收集上清液。