[发明专利]一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计及其检测方法

权利要求书

1.一种水稻耐低温基因COLD1新功能标记的引物，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记由5条引物组成，即正、反向外引物各1条，正向内引物2条，反向内引物1条；正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；检测粳型COLD1^Jap的反向内引物为COLD1-I-R；检测籼型COLD1^Ind的正向内引物有两条，即COLD1-I-F1和COLD1-I-F2；

COLD1-O-F序列为CATTTCCCCATGCCTTCTCC；

COLD1-O-R序列为CAACTGTCCCAACGATACGC；

COLD1-I-F1序列为CCTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAT；

COLD1-I-F2序列为CTGGCTTACAGGGAAATTGATGAGAC；

COLD1-I-R序列为GAGCTGCCTTTCCAATGTTTTGATGTTCT。

2.一种如权利要求1所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物的设计方法，其特征在于，所述水稻耐低温基因COLD1新功能标记的设计方法包括：

第一步，从NCBI网站下载水稻COLD1基因的DNA序列；

第二步，根据基因在籼型COLD1^Ind为碱基T或C，在粳型COLD1^Jap为碱基A，设计内引物，内引物的3'端落在SNP差异位点上，与该位点碱基相同或互补；籼型COLD1^Ind的特异性内引物为正向内引物COLD1-I-F1和COLD1-I-F2，分别鉴定等位差异碱基T和C，为增强特异性，在两条内引物的3'端的第3个碱基均引入一个错配碱基，即碱基A变为G；粳型COLD1^Jap的特异性内引物为反向内引物COLD1-I-R，鉴定等位差异碱基A，同理，为增强特异性，在该引物的3'端的第3个碱基引入一个错配碱基，即碱基C变为T；

第三步，在内引物的两翼设计外引物，外引物用在线引物设计软件进行设计，正反外引物均位于保守区域CDS编码区，正向外引物用COLD1-O-F表示，反向外引物用COLD1-O-R表示；

3.一种利用权利要求1所述的水稻耐低温基因COLD1新功能标记引物对水稻基因COLD1进行检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：

第一步，水稻DNA的提取

取水稻的叶片0.3-0.4g，按照CTAB方法进行DNA提取；

第二步，功能标记的PCR扩增

(1)仅检测COLD1基因的粳籼性，即检测COLD1^Jap或COLD1^Ind，PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，5引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg²⁺Buffer 1.2μL，dNTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H₂O 12μL；

(2)当检测到为籼型COLD1^Ind时，进一步鉴定其差异性位点碱基，则将(1)的引物混合液组分构成更改，只用任一条正向内引物与两条外引物和1条反向内引物组成4引物，即正向外引物、反向外引物、任一正向内引物和反向内引物组成4引物混合液；PCR扩增体系为20μL：浓度为10～100ng/L的DNA 2μL，4引物混合液2μL，10×Taq Buffer 2μL，Mg²⁺Buffer 1.2μL，d NTP Mixture 0.4μL，Taq DNA聚合酶0.4，dd H₂O 12μL；

第三步，琼脂糖凝胶电泳及观察拍照

将第二步的(1)和(2)反应体系中的扩增产物在1.5-2％的琼脂糖凝胶中于120V电泳35-45min，用核酸染料染色，在紫外凝胶成像仪上观察及拍照。