[发明专利]咪唑并[1,2-a]吡啶近红外比率型pH荧光探针及其制备和应用

说明书

本发明公开了基于咪唑并[1,2‑a]吡啶近红外比率型pH荧光探针及其制备方法，以及该探针用于活细胞和大肠杆菌内极度酸性pH变化的测定。在惰性气体保护下，将4‑二甲基氨基肉桂醛或其衍生物，4‑氯苯胺和碳酸氢钠溶于甲醇，加热回流反应后；和2‑(4‑甲氧基苯基)‑7‑甲基咪唑并[1,2‑a]吡啶溶于N,N‑二甲基甲酰胺，以叔丁醇钾为碱性试剂，加热回流反应；浓缩后，经硅胶柱分离。该探针在极度酸性条件下其发射波长大于600nm处于近红外区并且呈现比率发射荧光特性，同时兼具对H+高度灵敏性、良好的选择性和大的Stokes位移等优点。

技术领域

本发明涉及荧光探针，具体属于咪唑并[1,2-a]吡啶类近红外比率型pH荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

氢离子是重要的细胞内物质之一，在调控细胞、酶和组织功能中发挥着重要的作用。不同的原核生物以及真核细胞的不同亚细胞器内的pH值从碱性到强酸性不等。许多疾病与细胞内异常的氢离子浓度有关，严重时会引发诸如炎症、癌症和阿尔茨海默症等。因此，对细胞内pH进行灵敏、准确的实时监测，可以为分子水平上研究细胞的生理和毒理过程提供重要的信息。

在检测细胞内pH的众多方法中，荧光分析法具有非破坏性、高灵敏性、响应速度快、高信噪比以及能够连续检测pH变化的快速动力学过程等特性。此外，结合激光共聚焦显微镜，荧光成像技术成为分子水平上进行实时原位监测细胞内pH的重要手段。其中，近红外荧光探针的发射波长为650-900nm，在这一范围内细胞的自发荧光较弱，可以很好的规避背景干扰而获得更高的准确性，而且使用发射波长大于600nm的光，不仅能减少光毒性，还能渗透组织达数厘米，甚至可以对活体组织进行造影，这大大增加了对疾病监测和诊断的准确性，同时兼顾的比率荧光发射特性，可以通过同时记录两个不同发射波长的荧光强度，并计算它们的比值可以有效避免例如：溶剂极性、探针浓度在细胞内负染不均、温度、仪器等其他环境因素的干扰，从而达到对分析物精确的定量分析。迄今为止，文献报道了许多性能优异的比率型pH荧光探针，但该类探针大多数适用于弱酸性亚细胞器(如：溶酶体和内涵体，pH 4.0-5.5)和近中性细胞质(pH 6.8-7.4)内pH的检测。遗憾的是，对于极度酸性(pH4)环境下，基于近红外比率型pH荧光探针的研发缺乏关注，导致这方面的pH荧光探针种类十分有限。虽然对于大多数生物来说，极度酸性是致命的，但是大量的微生物包括“嗜酸菌”和幽门螺杆菌已经进化到可以在这种极度酸性条件下存活。还有肠道致病菌，它能够经过哺乳动物极度酸性的胃液(pH 0.9-1.5)到达小肠，引起致命的感染。这就迫切需要开发有效的比率型极度酸性pH荧光探针，并且兼具大的Stokes位移，高的灵敏性、良好的选择性、光稳定性以及低毒性等特性，应用于细胞及大肠杆菌内极度酸性的检测。

发明内容

本发明的目的之一是提供咪唑并[1,2-a]吡啶类近红外比率型pH荧光探针；目的之二是提供该探针的制备方法，该方法工艺简单、成本低廉；目的之三是提供该探针的用途，即在检测细胞内酸性pH变化中的应用，以及在检测大肠杆菌内极度酸性pH变化中的应用。该探针对H⁺有高的灵敏度和选择性，且对pH变化的检测表现为成比率发射，并具有大的Stokes位移，能够有效减小激发光和细胞或生物样品自身荧光的干扰。

本发明提供的一种咪唑并[1,2-a]吡啶类近红外比率型pH荧光探针，结构式如下：

本发明提供的咪唑并[1,2-a]吡啶类近红外比率型pH荧光探针的制备方法，合成路线如下：

本发明提供的咪唑并[1,2-a]吡啶类近红外比率型pH荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)在惰性气体保护下，将4-二甲基氨基肉桂醛，4-氯苯胺溶于无水乙醇，加热回流4小时后，将反应液冷却至室温，倒入大量的蒸馏水中，用二氯甲烷溶剂萃取，减压蒸馏；