[发明专利]可原核表达樱桃小果1号病毒RdRp蛋白的质粒载体及其应用

权利要求书

1.一种原核表达樱桃小果1号病毒可溶性RdRp蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将质粒载体pMAL-LC-RdRp转化大肠杆菌感受态细胞，挑取含重组质粒的大肠杆菌菌株置于含IPTG的LB液体培养基中进行诱导培养，所述IPTG的终浓度为0.4mmol/L，诱导培养的温度为18℃；

(2)将诱导培养后的菌液进行超声波破碎，离心，收集上清液；

(3)将上清液进行亲和层析，得到纯化的可溶性RdRp蛋白，可溶性RdRp蛋白在上清液中的相对比例为35％；

所述质粒载体pMAL-LC-RdRp由如下方法构建而成：

首先利用RT-PCR方法，设计SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物扩增含有RdRp编码序列的片段，从而获得含有RdRp蛋白编码序列，然后将获得的片段通过T4连接酶连接到pGEM-T上，从而获得含有RdRp蛋白编码序列的质粒；25μL RT反应体系为：植物总RNA，5.0μL，LCh1-8-8614-R，5.0μL，10mmoL/L dNTP，4.0μL，ddH₂O，5.0μL；80℃，3min，冰上5min；5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer，5.0μL，Reverse Transcriptase M-MLV，0.5μL，Recombinant RNase Inhibitor，0.5μL；42℃，90min；

所述含有RdRp编码序列的片段包括：RdRp前600bp+RdRp+RdRp后120bp；

然后利用PCR方法以含有RdRp蛋白编码序列的质粒为模板，再设计含有酶切位点的引物SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，获得LChV-1RdRp蛋白的编码序列；25μL PCR反应体系：2.5μL10×PCR缓冲液，1μL dNTP，LCh1-8-6324-F和LCh1-8-8614-R各1μL，1μL RT反应产物，1μLTaq DNA聚合酶，补ddH₂O最终反应体积为25μL；PCR反应过程为94℃预变性5min，94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃ 10min；

然后将RdRp蛋白的编码序列利用酶切和连接插入到pMAL-C2X载体中，即构建得到质粒载体pMAL-LC-RdRp；所述质粒载体中含有SEQ ID NO.1所示的编码樱桃小果1号病毒RdRp蛋白的序列。

2.由权利要求1所述的方法原核表达的樱桃小果1号病毒可溶性RdRp蛋白在LChV-1基因组复制调控研究中的应用；所述樱桃小果1号病毒可溶性RdRp蛋白特异性识别LChV-1基因组的3'末端长度为207nt的序列，产生其互补链。