[发明专利]犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型的实时荧光定量PCR检测及鉴别引物和探针

说明书

本发明公开了一种犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的实时荧光定量PCR检测及鉴别引物和探针，并基于该引物和探针提供用于同时鉴别检测犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的试剂盒，属于生物检测技术领域。利用该试剂盒的检测操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性好，不仅可用于犬腺病毒的检测，还可实现I型和II型犬腺病毒的鉴别，更可以实现I型和II型犬腺病毒的准确定量，将在犬腺病毒、I型和II型犬腺病毒的检测及疫苗生产过程中的质量监控和合理化配苗中发挥重要作用。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，涉及一种用于对犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型进行定性、定量和鉴别检测的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其专用引物和TaqMan探针。

背景技术

犬腺病毒(Canine adenovirus,CAV)

犬腺病毒(CAV)属腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，为双股，线状DNA病毒。CAV是哺乳动物腺病毒属中致病性最强的一种病毒，与人腺病毒具有相似的基因结构。根据其血凝和中和试验等特性不同可将CAV分为I型和II型，CAV-I型和CAV-II型之间纤突蛋白的核苷酸同源性约为80％。纤突蛋白在病毒吸附到细胞表面受体的感染过程中起着决定性作用，CAV-I型与CAV-II型纤突基因的不同性预示着两者在毒力和对不同细胞亲嗜性上存在着差异，CAV-I型对血管内皮细胞有较强的亲嗜力，因此引起犬的致死性肝炎，其临床表现是抑郁、厌食、鼻出血、呕吐、腹痛、血性腹泻、粘膜充血、黄疸、肾小球性肾炎、前葡萄膜炎和角膜水肿，出现蓝眼睛的特征性临床症状，而脑炎是野生犬种CAV-I感染的主要病理学发现；CAV-II型则引起上呼吸道感染和肠道感染，临床症状主要引起与呼吸道疾病和肠炎相关的犬接触性呼吸道疾病，但不引起肺炎症状，可引起幼犬咳嗽又叫犬窝咳。

CAV-I型在世界上分布范围较广泛，在澳大利亚、美国、丹麦、加拿大和英国等国家普遍存在，在饲养犬、狐狸、熊、土狼、红狐狸等其他肉食动物中流行。CAV-I型于1925年首次被发现，1947年CAV-I型被认定为犬病原体，1984年，在我国首次分离到该病毒。Pintore MD等人发现CAV-I型病毒和巴斯德氏杆菌共感染，并在臭鼬、浣熊、狐狸和猫鼬中检测到CAV-II型的天然存在的抗体，该病毒可通过与污染的唾液，尿液和粪便直接接触进入宿主。CAV-I型主要发生于1岁以内的幼犬，并且CAV-I和CAV-II型的病毒共感染频率较高，在相同的生物学基质中均可检测到两种CAV类型，两者存在免疫学交叉反应，近年来犬类感染CAV-I型时较多表现为无明显症状，故迫切需要一种可快速、高敏感度、特异性的CAV检测技术和鉴别CAV-I和CAV-II型的鉴别检测方法。

现有学者建立了用于同时检测犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒(不区分I型和II型)的多重PCR检测引物，鉴别犬细小病毒、犬瘟热病毒、犬副流感病毒和犬腺病毒2型的四重PCR检测方法，犬瘟热病毒、犬腺病毒Ⅱ型和犬副流感病毒的多重PCR检测引物组以及用于鉴别犬瘟热病毒野毒株与疫苗株的TaqMan探针荧光定量PCR检测试剂盒及应用，但均不涉及用于犬腺病毒I型和II型鉴别的研究。

在利用CAV病毒进行疫苗生产过程中，其原材料如细胞、培养基等不能含有CAV病毒，同时制作疫苗的CAV种毒必须是背景清晰，备案的病毒，而来源于原材料中的CAV病毒有可能是背景不清晰的野毒株，会影响生产的疫苗的安全性；尤其是CAV病毒中I型属于强毒株，不能用于疫苗生产，所以必须排除原材料中可能含有的CAV病毒，尤其是I型CAV病毒对种毒纯净性的干扰，因此，有必要对犬腺病毒、犬腺病毒I型和犬腺病毒II型进行检测与鉴别，以保证疫苗生产的安全性。