[发明专利]一种区分鹿自然感染牛分枝杆菌和免疫卡介苗的检测方法及其基因检测特异性引物

权利要求书

1.一种区分鹿自然感染牛分枝杆菌和免疫卡介苗的检测方法及其基因检测特异性引物，其特征在于：包括如下步骤：

(1)生物样本的前处理：生物样本中加入含有20mmol/LTris-HCl、1％Triton X-100作为处理液，混匀后离心，弃去上清，加入TE缓冲液，重悬沉淀，得到样本液；

(2)双重PCR检测：提取步骤1所得样本液中的生物基因组DNA；使用提取的生物基因组DNA作为PCR扩增的DNA模板，引物为牛分支杆菌基因检测特异性引物，进行PCR扩增；产物进行琼脂糖凝胶检测；

(3)结果判定：琼脂糖凝胶检测结果中如果出现了285bp和969bp两条带，结果判定为生物样本中含有生物个体自然感染的牛分支杆菌；如果只出现969bp一条带，结果判定为免疫卡介苗；或未检测到任何一条带，结果判定为生物样本中不含有生物个体自然感染的牛分支杆菌并且未免疫卡介苗。

2.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(1)所述的生物样本为液体样本；所述的生物样本为鹿的鼻腔分泌物、血液或胸腔积液。

3.根据权利要求2所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：所述血液为静脉血。

4.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(1)所述加入的处理液体积为生物样本体积的50％；所述处理液中，Tris含量为20mmol/L，用1M的HCl调节pH为8.3；所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。

5.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(1)所述TE缓冲液中，包括10mmol/L的Tris、1mmol/L的EDTA，用1M的HCl调节pH为8.0；所述TE缓冲液的加入体积与原生物样本体积相等。

6.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(2)所述提取生物基因组DNA，具体为：在步骤(1)所得样本液中加入蛋白酶K，水浴硝化后，加热保温，然后加入三氯甲烷，离心后取上清液作为DNA模板。

7.根据权利要求6所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(2)中所述加入蛋白酶K的终浓度为100μg/mL；所述水浴消化，温度为56℃，时间为30min。所述加热保温，温度为98℃，时间为10min；所述加入三氯甲烷，加入体积与原体系体积相等。所述离心，离心转速为13000r/min，离心时间为5min。

8.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增，牛分支杆菌基因检测特异性引物包括4种引物：

牛分支杆菌ESAT-6基因上游引物ESAT-6-F：5’GAATTTCGCGGGTATC 3’，下游引物ESAT-6-R：5’GATTCCCAAGCTTCCTATG3’；

牛分支杆菌Ag85B基因上游引物Ag85-F:5’GTGAGCCGAAAGATTCG 3’，下游引物Ag85-R：5’CAGCCGTCGACTAACGAACGTC3’。

9.根据权利要求1所述的检测牛分枝杆菌区分卡介苗免疫的方法，其特征在于：步骤(2)所述PCR扩增反应条件如下：在25μL反应体系中，分别加入10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP0.5μL(10mmol/L)、MgCl 12.5μL(2.5mmol/L)、牛分支杆菌基因检测特异性引物4种各10pmol、Taq DNA聚合酶(Fermentas公司)0.1μL(5U/μL)、DNA模板1μL，用水补至25μL，于PCR仪上进行PCR DNA扩增；PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸60s，30个循环；72℃延伸10min。

10.一种权利要求1-9任一项所述方法中使用的牛分枝杆菌基因检测特异性引物，其特征在于：包括4种引物：

牛分支杆菌ESAT-6基因上游引物ESAT-6-F：5’GAATTTCGCGGGTATC 3’，下游引物ESAT-6-R：5’GATTCCCAAGCTTCCTATG3’；

牛分支杆菌Ag85B基因上游引物Ag85-F:5’GTGAGCCGAAAGATTCG 3’，下游引物Ag85-R：5’CAGCCGTCGACTAACGAACGTC3’。