[发明专利]伯氏疏螺旋体核酸检测用引物、试剂盒、应用及其检测方法

说明书

本发明公开一种伯氏疏螺旋体核酸检测用引物、试剂盒、应用及其检测方法，其特征在于：包括一组特定引物和一条探针，其中一组特定引物的序列分别为：引物1：5’‑TCTTTTCTCTGGTGAGGGAGCT‑3’；引物2：5’‑CCTTCCTGTTGAACACCCTCT‑3’；探针序列为：5’‑FAM‑AAACTGCTCAGGCTGCACCGGTTC‑BHQ1‑3’。本发明利用特定的一组引物和探针即可检测伯氏疏螺旋体多种亚型，具有简单、方便、快速、准确、高效的优点。

技术领域

本发明涉及一种伯氏疏螺旋体核酸检测用引物、试剂盒、应用及其检测方法，样本封闭，避免交叉污染；本试剂盒具有抗干扰作用强，特异性、专一性强，避免假阳性结果；本发明最低检出限原虫率可达1％，扩增过程采用人源管家基因做内标质控品，避免核酸提取额外添加，降低人为操作干扰风险。

背景技术

莱姆病是一种以蜱为媒介的螺旋体感染性疾病，是由伯氏疏螺旋体所致的自然疫源性疾病。我国于1985年首次在黑龙江省林区发现本病病例，以神经系统损害为该病最主要的临床表现。其神经系统损害以脑膜炎、脑炎、颅神经炎、运动和感觉神经炎最为常见。其中一期莱姆病仅用抗生素即可奏效，至二期、三期用抗生素无济于事，特别是神经系统损害更乏特效疗法。早期以皮肤慢性游走性红斑为特点，以后出现神经、心脏或关节病变，通常在夏季和早秋发病，可发生于任何年龄，男性略多于女性。发病以青壮年居多，与职业相关密切。以野外工作者、林业工人感染率较高。

伯氏疏螺旋体，螺旋体科疏螺旋体属的一种病原体，与梅毒同属于螺旋体科(梅毒螺旋体是密螺旋体属)，有3-10个稀疏而不规则的螺旋，呈波浪状。伯氏疏螺旋体革兰氏阴性，常用Giemsa染色，两端稍尖，运动活泼，可进行人工培养，但营养要求较高，生长缓慢。根据DNA-DNA杂交和5S-23SrRNA基因间隔区Mse Ⅰ限制性酶谱分析,目前全球伯氏疏螺旋体至少可分为20个不同的基因型,包括B.burgdorferisensustricto,B.bavariensis,B.garinii,B.japonica,B.afzelii,B.valaisiana,B.lusitaniae,B.andersonii,B.americana,B.kurtenbachii,B.tanukii,B.turdi,B.bissettii,B.sinica,B.spielmanii,B.californiensis,B.carolinensis sp.nov,B.yangtze,B.finlandensis和B.chilensis。其中11种曾从人体内分离和检测到(B.burgdorferi s.s,B.garinii,B.afzelii,B.bavariensis,B.bissettii,B.kurtenbachii,B.japonica,B.spielmanii,B.valaisiana,B.lusitaniae和B.yangtze),另外9种只能从各种蜱和啮噬动物体内分离和检测到。目前公认B.burgdorferi s.s,B.garinii,B.afzelii,B.bavariensis和B.bissettii具有致病性，而随着B.valaisiana,B.lusitaniae,B.kurtenbachii和B.spielmanii相继从患者体内分离到,也被认为具有致病性，但是部分基因型的致病性及其与相关临床症状之间的关联性还未得到证实。伯氏疏螺旋体不同基因型之间存在明显的差异,从不同地区分离的菌株具有遗传多态性和抗原异质性。

从血、脑脊液及病变皮肤等标本中可检出螺旋体。采用免疫荧光、免疫转印等方法可在患者血中测出特异性抗体。病原体分离及特异性抗体检测具有确诊意义。荧光PCR法检测患者血、尿、脑脊液及皮肤标本等莱姆病螺旋体DNA(Bb-DNA)，并同时可测出所感染菌株的基因型。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种利用特定的一组引物和探针即可检测伯氏疏螺旋体多种亚型，简单、方便、快速、准确、高效的伯氏疏螺旋体核酸检测用引物。