[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法

权利要求书

1.利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：包括如下步骤：

S1.在斑马鱼asap1a基因上选择asap1a-gRNA靶位点，分析确认asap1a-gRNA靶位点敲除特异性；

S2.制备asap1a-gRNA；

S3.将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率；

S4.鉴定F0代斑马鱼子代即F1代斑马鱼卵中asap1a基因类型，进而筛选出亲本F0代斑马鱼中可以遗传的asap1a敲除突变体；

S5.筛选F2代斑马鱼中asap1a基因敲除纯合突变体，培养获得稳定遗传的斑马鱼asap1a基因敲除突变体，即完成利用CRISPR/Cas9技术对斑马鱼asap1a基因敲除突变体的构建。

2.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点序列为SEQ ID NO.1所示序列。

3.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S1中asap1a-gRNA靶位点位于斑马鱼asap1a基因第五个外显子上。

4.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2中制备asap1a-gRNA的方法为：

S2.1将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体；

S2.2从重组的pDR274-asap1a-gRNA质粒中扩增T7promoter-asap1a-gRNA；

S2.3扩增的产物进行PCR产物回收并进行体外转录得到asap1a-gRNA。

5.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.1中将asap1a-gRNA靶位点的DNA序列连接入pDR274载体的引物序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示序列。

6.根据权利要求4所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S2.2中扩增T7 promoter-asap1a-gRNA引物序列为SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.5所示序列。

7.根据权利要求1所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3将asap1a-gRNA和Cas9mRNA导入斑马鱼中制备F0代斑马鱼，并鉴定asap1a-gRNA靶位点打靶效率，具体为：

S3.1将体外转录获得的asap1a-gRNA与Cas9mRNA混合后通过显微注射导入斑马鱼受精卵，其中asap1a-gRNA终浓度为100ng/μL，Cas9 mRNA终浓度为300ng/μL，导入体积为：1nL/卵；

S3.2选取50粒已经导入asap1a-gRNA与Cas9mRNA的受精后24h的斑马鱼卵并混合提取鱼卵基因组，且以此混合基因组为模板扩增asap1a-gRNA靶位点上下游序列各约150bp，将扩增产物测序后与野生型斑马鱼DNA序列进行比对，计算设计的asap1a-gRNA靶位点敲除效率。

8.根据权利要求7所述的利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼asap1a基因敲除突变体的方法，其特征在于：所述步骤S3.2中扩增asap1a-gRNA靶位点上下游序列各约150bp的引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示序列。