[发明专利]具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用

说明书

本发明提供了一种具有高效基因递送能力的三维星型α螺旋聚多肽及其制备方法与应用，以树枝状分子为引发剂，二氯甲烷为反应溶剂，引发不同类型的N‑羧酸酐单体的高速开环聚合，并通过点击化学反应在末端引入不同电性的基团。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，同时拓扑结构为开环聚合反应初期的加速作用提供了契机。聚多肽侧链修饰的胍基/氨基等带来了较高的正电荷密度，可以通过正负电荷间的静电作用获得高效的基因负载能力，且增强了二级结构上的α螺旋刚性结构进而使聚多肽拥有更强的穿膜能力；该类聚多肽的这些性能使其在生物医用材料尤其是基因递送领域中具有巨大的开发前景。

技术领域

本发明涉及基因负载和递送领域，具体涉及具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽及其制备方法与应用，可应用于乳腺癌的光热-基因联合治疗。

背景技术

基因递送载体是用于负载核酸分子，将其导入目标靶细胞并成功表达的必要的介质，主要分为病毒载体和非病毒载体两类。病毒载体由于转导效率和表达效率高的优势得到了广泛的利用，但其本身的抗原性，潜在的致瘤风险以及基因装载量不足的缺点严重制约了其发展。基于此，非病毒载体渐渐得到重视。常用的非病毒载体有脂质体、纳米颗粒、阳离子聚合物和多糖等。

α螺旋聚多肽，特别是阳离子型聚多肽作为一类新型、高效的基因递送载体，虽然归属于此类，但与传统的聚合物的内吞机制不同，这类聚多肽主要通过α 螺旋的刚性二级结构在生物膜上“打孔”的模式穿透细胞膜。但高剂量使用或与细胞长时程接触时，聚多肽会在生物膜上打出过多的孔道，造成显著的细胞毒性。

发明内容

本发明提供了一种三维拓扑结构的星型聚多肽，选用树枝状分子为引发剂，分别以二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺为反应溶剂，引发N-羧酸酐单体的开环聚合，并通过小分子修饰得到。树枝状分子表面丰富的氨基提供了足够的聚合位点，使聚多肽形成了三维球形拓扑结构，并且由于二氯甲烷的低介电常数的性质，开环聚合初期形成的拓扑结构促进了后期聚合的加速，大大缩短了聚合所需的时间，本发明阳离子聚多肽利用自身的正电荷通过正负电荷间的静电作用吸附并压缩核酸分子，同时主要利用聚合物同时主要利用聚合物的刚性的α螺旋结构在细胞膜表面打孔并进行穿膜，其中侧基为胍基的聚多肽的穿膜能力比 Arg9、HIV-Tat 等经典细胞穿膜肽提高了 1~2个数量级。如果将胍基等正电荷基团和芳香基团共同引入聚多肽侧链，可以通过疏水作用又能够提高聚多肽与siRNA的复合能力，从而提高聚多肽的基因沉默效率。若共同引入负电荷基团则能提高聚多肽的体内循环能力。另外α螺旋阳离子聚多肽也可以在溶酶体/内含体膜上“打孔”，因此可以高效地低能耗地递送核酸分子进胞并逃避内含体/溶酶体，实现高效的基因转染。

本发明采用如下技术方案：

一种具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽，具有式（I）所示的结构；

式中，R₁为树枝状分子聚丙烯酰胺单元，R₂为N-羧酸酐单体单元，R₃为电性小分子单元。

上述具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法包括如下步骤，将树枝状分子聚丙烯酰胺引发N-羧酸酐化合物聚合得到中间体；然后将中间体与电性小分子反应，得到具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。

上述三维球形α螺旋阳离子聚多肽的制备方法具体包括如下步骤：

（1）具有式（II），式（III），式（Ⅳ）或式（Ⅴ）结构的树枝状分子聚丙烯酰胺与N-羧酸酐化合物在有机溶剂中反应得到中间体；所述N-羧酸酐化合物为γ-(4-炔丙氧基苄基)-L-谷氨酸-N-羧酸酐、γ-炔丙基-L-谷氨酸盐-N-羧酸酐或者N,N-苄氧羰基-L-赖氨酸酸酐；

（2）将所述中间体与电性小分子通过点击化学反应得到式（I）具有高效基因递送能力的三维球形α螺旋阳离子聚多肽。