[发明专利]由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法

权利要求书

1.从胎盘间充质干细胞中分离提取细胞因子的方法，该方法包括如下步骤：

1)提供处于对数生长期的第2~5代人胎盘间充质干细胞，以5000~15000个/cm²的密度接种至包含2mM的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基中培养，培养3-4天后，收集上清，以20000g离心力离心20min除去细胞以及碎片，再经0.22μm滤膜过滤，向所得滤液中添加甘露糖磷酸酯钠使溶解，得到培养上清；甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.05~0.1%；

2)将Pudex葡聚糖凝胶过滤介质Pudex G-25用玻璃棒引流导入层析柱中，边装边用玻璃棒搅拌；

3)装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再将步骤1)收集的培养上清加载到层析柱中；

4)盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，打开恒流泵和收集器装置，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱并收集包含细胞分泌物的洗脱馏份，向所得洗脱馏份中添加氯化镁使溶解，作为层析液；氯化镁添加量占洗脱馏份的质量/体积百分浓度为0.02~0.05%；

5a)使用切向流超滤系统对层析液进行浓缩，用超纯水冲洗管路，安装100kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤4)所得层析液5L进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为外泌体浓缩液，同时得到超滤过滤液；

5b)重新安装1kD 100cm²的MidiKros过滤器，对步骤5a)所得超滤过滤液进行过滤浓缩，得到100ml浓缩50倍的回流液为细胞因子浓缩液；

6)将细胞因子浓缩液分装，在-80℃条件冷冻保存；或者向细胞因子浓缩液中添加冻干赋形剂后冷冻干燥。

2.根据权利要求1的方法，其中所述切向流超滤系统是仕必纯KR2i型切向流超滤系统。

3.根据权利要求1的方法，步骤1)中，以10000个/cm²的密度接种细胞。

4.根据权利要求1的方法，甘露糖磷酸酯钠添加的质量/体积百分浓度为0.08%。