[发明专利]一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用

说明书

本发明涉及一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用，包括以下步骤：（1）基础层析介质Sephadex G‑75活化后，分别与1，3‑二氨基‑2‑羟基丙烷、三聚氯嗪、2‑氨基并噻唑反应，合成玻璃酸酶特异性层析介质；（2）利用合成的特异性层析介质纯化玻璃酸酶粗品。通过Sephadex G‑75为骨架，三聚氯嗪为间臂连接的1，3‑二氨基‑2‑羟基丙烷和2‑氨基并噻唑为配体，利用分子间的相互作用力，特异性吸附玻璃酸酶，变换缓冲液条件，分别洗脱杂质蛋白和玻璃酸酶。本发明能够高效率、大规模生产玻璃酸酶，玻璃酸酶回收率达到86.6%，玻璃酸酶活性高达4500 IU/mg。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及的是一种生物医药技术领域的纯化方法。特别是一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用。

背景技术

玻璃酸酶，又称透明质酸酶，是一种碱性糖蛋白，属内切糖苷酶。能催化玻璃酸、硫酸软骨素A、硫酸软骨素C的β-N-乙酰氨基己糖糖苷键水解。它在哺乳动物的睾丸里含量很丰富，能水解透明质酸，使其粘滞性明显下降，有利于受精时精子进入卵子。也存在于精子、颌下腺、蛇毒、皮肤、脾脏、水蛭及细胞的溶酶体中。临床用于局部注射，可加速皮下、肌内注射药液的吸收，促进局麻药的浸润，促进手术及创伤后局部水肿或血肿的扩散，也用于肠粘连。

国内外对于玻璃酸酶的研究主要集中在各种毒液，已从多种毒液中分离纯化出玻璃酸酶。哺乳动物的睾丸中玻璃酸酶含量很高，但对于哺乳动物中玻璃酸酶的报道较少，且几乎都是早期报道。

现有技术“CN 201210598018.7一种玻璃酸酶的提取方法”选用猪睾丸为原材料，采用高速离心和过滤提取方法，对玻璃酸酶进行分离和纯化，使玻璃酸酶效价可以达到340IU/mg。“CN 201310047266.7牛或羊玻璃酸酶的生产方法”通过原料预处理，匀浆，超声波浸提，搅拌提取，硫酸铵除杂，硫酸铵沉淀，透析，阳离子交换色谱层析，凝胶过滤色谱层析，真空冷冻干燥等工艺步骤，得到的玻璃酸酶效价≥1500单位。“CN 201110176365.6一种牛睾丸制备玻璃酸酶的方法”提供了一种睾丸提取液经葡聚糖凝胶Sephadex G-75层析，冷冻干燥，得到玻璃酸酶纯品。该方法所得玻璃酸酶活性达700 U/mg以上，收率达9.2%。现有技术中，方法包括离心过滤、色谱层析、凝胶过滤层析等。凝胶过滤层析利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据分子量的差别进行分离，是精细纯化所采用的理想技术。“CN201310369641.X玻璃酸酶的仿生亲和纯化方法”提供了一种利用基础层析材料制备玻璃酸酶亲和性材料，通过其对玻璃酸酶的专一性吸附，达到纯化的目的。该法所得玻璃酸酶活性最高达1800 IU/mg。

现有技术还是存在收率低、效价低的缺点，因此，有必要开发一种效率高、效价高的玻璃酸酶层析介质及其应用方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种玻璃酸酶特异性层析介质的合成和应用，使其克服玻璃酸酶大规模纯化中的缺点，在大规模分离纯化时步骤少、成本低、效率高，利用特异性层析介质中与玻璃酸酶间的相互作用力，可快速、简便、低成本、大批量纯化玻璃酸酶。

因此，本发明的目的在于提供一种玻璃酸酶的特异性层析介质；

本发明的另一个目的在于提供一种玻璃酸酶特异性层析介质的应用方法。

本发明通过以下技术方案实现，以基础层析介质葡聚糖凝胶（Sephadex G75）作为骨架合成特异性层析介质，以合成的特异性层析介质作为分离材料纯化玻璃酸酶。

本发明包括以下步骤：

步骤一、特异性层析介质的合成：

（1）基础层析介质Sephadex G-75加入活化缓冲液，40℃搅拌2.5 h，10倍体积纯化水洗涤后，抽干呈湿饼状；