[发明专利]一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法

说明书

本发明公开了一种维生素k2(MK‑7型)的发酵方法，使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，培养基采用浓配方，发酵过程中流加葡萄糖，有效补充菌体生长所需的营养，发酵过程中补加磷酸、氨水，分阶段分阶段严格控制pH，有效保障菌体生长代谢最适PH，通过调节转速、空气流量、罐压分阶段控制溶氧，有效提高氧的利用率减少氧对菌体细胞损伤，流加葡萄糖后，发酵液总糖浓度控制在0.3‑0.7％左右，在这个范围内菌丝的正常生长且代谢稳定，本发明可将维生素k2(MK‑7型)发酵单位提高至80mg/L，既能显著提高发酵单位，又为维生素k2(MK‑7型)的发酵产业化提供一个良好的方法。

技术领域：

本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法。

背景技术：

K族维生素是人体必需的四种脂溶性维生素之一，按照来源不同可以分为k1和k2两种，其中，k1主要来源于植物，也称叶绿醌，k2主要来源于微生物也称甲萘醌。因其在食品中量极少。素有“铂金维生素”之称，在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被科为“第四代抗骨质疏检产品”；还可防止肝硬化肝纤推化转化为肝癌，促进肝细胞再生；同时在预贴和治疗的金森在方面也其行定的疗效。

天然维生素K2，为MK-7型，仅能通过微生物发酵法获得，相比通过化学合成的维生素K2，天然维生素K2活性更高。为满足天然维生素K2不断增长的市场需求、克服化学法来源维生素K2的缺点，市场上急需通过微生物发酵规模化生产天然维生素K2。

目前，利用微生物发酵生产维生素K2主要包括利用纳豆芽孢杆菌、黄杆菌、乳酸菌等，本发明所采用的菌种为纳豆芽孢杆菌，属于枯草牙孢杆菌(Bacillus subtilis)，该菌为美国FDA公布的40种益生菌之一，食用安全，是维生素K2生产的优良菌种。但是，采用纳豆芽孢杆菌发酵发酵水平不高，CN201410472873.2，CN 104328064 A采用新型供氧策略优化菌种发酵工艺，并进行发酵罐放大，最终维生素K2产量达到60.54mg/L。此外，维生素K2产业化难度较大，目前报道较少。

发明内容：

针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法。

本发明的一种维生素k2(MK-7型)的发酵方法，使用的菌种为纳豆芽孢杆菌，包括以下步骤：

(1)将保存在甘油管的菌株接入固体培养基中进行菌种活化，37℃培养箱中培养，20～28h，连续活化两代，固体培养基配方为：葡萄糖3％L，蛋白胨2％，NaCl 0.5％，酵母膏0.5％，琼脂2％，溶剂为水；

(2)利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有种子培养基的种子罐中，种量0.1％(v/v)，通气量0.5～1.0vvm，搅拌转速200～400rpm，罐温35～37℃，培养18～24h，获得种子液，种子培养基配方为葡萄糖1-5％，蛋白胨2-8％，K₂HPO₄ 0.1-0.2％，LKH₂PO₄ 0.01-0.1％NaCl 0.2-0.4％，MgSO₄·7H₂O 0.01-0.1％，溶剂为水；

(3)将种子液接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量5～10％(v/v)，发酵过程中温度35～37℃，起始通气量0.5～2.0VVM，罐压0.04～0.07Mpa，培养72-120h，发酵生产维生素K2，发酵培养基配方为葡萄糖4-6.0％，甘油1-4.0％，酵母粉0.5-1.5％，大豆蛋白胨0.5-1.5％，NaCl 0.2-0.35％，KH₂PO₄ 0.05-0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.05-0.15％，溶剂为水；

所述发酵方法采用浓配方高密度发酵，该方法的发酵条件为：