[发明专利]一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA N6-甲基腺嘌呤修饰的方法

说明书

本发明提供一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA N⁶‑甲基腺嘌呤修饰的方法及试剂盒。该方法基于体内核糖核酸(RNA)腺嘌呤的N⁶‑烯丙基标记并化学处理诱导其在逆转录成DNA过程中发生碱基突变，然后通过核酸测序手段识别突变位点，进而得到a⁶A位点，该位点即为细胞RNA中原本m⁶A修饰的位点。本发明方法首次实现了在细胞内进行N⁶‑烯丙基腺嘌呤的特异性标记，该标记不但能够用于替换细胞内的N⁶‑甲基腺嘌呤位点，并且能够借助突变测序的手段进行定位。本发明方法与现有应用于m⁶A检测的基因测序技术相比，由于突变位点可以精确到单碱基的分辨率，提升了目前普遍采用的基于m⁶A抗体免疫沉淀与大规模平行测序方法检测m⁶A位点的精度，是一个直接的高通量单碱基鉴定方法。

技术领域

本发明属于基因测序领域，特别是一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA N⁶-甲基腺嘌呤修饰的方法及试剂盒。

背景技术

RNA不仅由胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)四种碱基组合而成。N⁶-甲基腺嘌呤(m⁶A)是RNA上极其重要的修饰碱基，在生物学过程中起到多种的生物功能，如调控基因的表达等。其中，修饰的鉴定及测序方法是研究其生物学意义的前提条件。

由于甲基修饰的腺嘌呤与普通腺嘌呤的物理化学性质接近，不能直接利用现有的一代或二代测序技术进行检测。目前，基于m⁶A抗体免疫沉淀测序技术(MeRIP-seq)可以使我们知道哪些转录本、基因组含有m⁶A修饰，但分辨率仅仅限制在100～200碱基区域范围内，不能区分哪个A被甲基化，也不能区分是单个A还是团簇的A被甲基化。为了提高分辨率，还采用了抗体/RNA光交联后免疫沉淀(CLIP)的方法，即抗体和RNA上m⁶A近邻的光活性尿嘧啶或硫代同源物交联，逆转录过程导致交联的尿嘧啶位点突变或在交联位置附近终止，进而通过分析突变或终止信息来间接认定尿嘧啶近邻的A为m⁶A位点。尽管该方法的分辨率得到了提升，但是位置鉴定是间接的，而且无法区分m⁶A团簇。

根据以上分析可知，现有的RNA上m⁶A位点的高通量分析手段未获得重大突破的原因主要是目前的抗体免疫沉淀富集技术始终是基于抗体富集的m⁶A序列片段，或者抗体与m⁶A序列片段上光活性尿嘧啶或硫代同源物的交联作用，来间接识别m⁶A的位点，没有直接通过m⁶A位点突变的方式来识别其位点。

我们希望利用可识别的修饰基团，通过将修饰基团接枝于氨基酸上，将带有修饰基团的氨基酸引入细胞代谢，替换m⁶A的甲基化修饰，然后再借助突变测序的方式，识别修饰基团所在位点，从而达到识别m⁶A位点的目的。但是在目前的培养条件下，带修饰基团的氨基酸与正常氨基酸在细胞代谢的竞争中处于劣势而无法引入细胞。

因此，一种适合修饰氨基酸引入细胞的培养条件亟待开发。

发明内容

针对现有技术中存在的缺点，本发明目的在于提供一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA N⁶-甲基腺嘌呤修饰的方法及试剂盒，不同于传统间接识别m⁶A位点的方法，通过突变测序的方式，用以单碱基分辨率下直接识别细胞全转录组RNA的m⁶A修饰位点。

本发明采用以下技术方案：

一种全转录组范围单碱基分辨率检测RNA N⁶-甲基腺嘌呤修饰的方法，包括以下步骤：