[发明专利]用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用。所述检测试剂包括：主要由第一引物和第二引物组成的引物对，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。本发明通过G‑四链体核酸拟酶催化底物氧化还原反应产生的颜色变化，能够以肉眼直接同时判断待测样品中是否含有大肠杆菌O157:H7，提高了检测食源性致病菌的灵敏度，使用G‑四链体核酸拟酶通过引入酶循环信号放大及PCR产物放大双重策略实现最终信号的放大，从而实现对大肠杆菌O157:H7的可视化检测。

技术领域

本发明特别涉及一种用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌检测的试剂、试剂盒及应用，属于分子生物学方法的检测技术领域。

背景技术

食源性病原微生物引起的公共卫生问题是世界上的一大难题，其漏检率高达95％以上。根据WHO估计，全球每年因食源性微生物感染性腹泻导致的死亡人口不少于200万人，其中大部分是由于饮食和饮水受到了微生物的污染，肠出血性大肠杆菌(EHEC)在食源性病原微生物污染中占有重要的卫生学地位。

EHEC大肠杆菌O157:H7主要长期存在于家畜家禽的肠道中，世界范围内的人类均有发病报道。大肠杆菌O157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis,HC)，阑尾炎，食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome,HUS)及血栓性血小板减少性紫癜(ThromboticThrombocytopenic purpura,TTP)等严重并发症，重者可引起死亡。据估计，美国每年大肠杆菌O157:H7暴发感染超过73,500人，在1999年江苏、安徽等地爆发了食源性污染大肠杆菌卫生事件，导致199人死亡，大肠杆菌O157:H7的感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情，导致这种病原体不仅成为一个重要的食品安全问题，而且是一个严重的医疗和公共卫生问题。

核酸拟酶是核酸的过氧化物酶样复合物，其通常为单链的DNA/RNA，核酸拟酶可以折叠成稳定和催化活性的G-四链体，在氯化血红素存在下与之结合可以催化一些化学反应产生颜色变化，可用于裸眼检测，将核酸拟酶结合传统PCR不仅可以避免核酸染料的污染，降低对实验器材的要求，简化传统PCR检测的操作步骤，提高检测方法的灵敏度，重要的是使检测肉眼可见也可以结合其他仪器进行定量的检测。

大肠杆菌O157:H7的检测通常使用传统的选择性培养基或变色琼脂。然而该方法的主要局限性在于数天的培养周期才能提供关于菌株性质或分离自身的准确信息，PCR已广泛用于检测来自食品和环境样品的大肠杆菌O157:H7，最近，实时PCR因其增强的灵敏度和特异性以及快速的周转时间而越来越受欢迎，现有检测大肠杆菌O157:H7的荧光定量方法，检测灵敏度达到80CFU/ml，但是使用的荧光定量PCR仪价值昂贵，使用成本高，在基层仍然不能满足监控的要求。传统的PCR仪需结合凝胶电泳的方法分析条带的大小和亮度来判断，不仅检测的灵敏度不及荧光定量PCR，且存在凝胶电泳操作步骤繁琐和实验室核酸染料的污染问题。随着传统PCR技术的普及以及便携仪器的开发，使得田间检测成为可能，但是凝胶电泳来观察结果费时费力且有一定的生物危害对实验操作者要求高，因此亟需一种基于传统PCR的便携、快速、灵敏、安全、可视化的检测方法，以及时有效地应对未来的爆发，必须有足够的敏感，特异和可靠的方法，用于快速便捷的检测大肠杆菌O157:H7。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种能够更加灵敏、快速便捷、可视化的用于大肠杆菌O157:H7血清型致病菌早期检测的核酸拟酶比色试剂、试剂盒及应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例一方提供了一种检测试剂，其包括：主要由第一引物和第二引物组成的引物对，所述第一引物和第二引物的序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。