[发明专利]一种尿液中外泌体的提取及其蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析方法

权利要求书

1.一种表面螯合金属离子的磁性纳米材料的制备方法，包括如下步骤：

1)在氧化石墨烯的表面修饰磁性纳米颗粒，得到产物1；

2)在所述产物1的表面包覆二氧化硅层，得到产物2；

3)在所述产物2的二氧化硅层表面修饰带有氨基的硅烷偶联剂，得到表面修饰有氨基的产物3；

4)在所述产物3的表面修饰金属螯合剂，得到产物4；

5)在所述产物4的表面螯合金属离子，即得到所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；

所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷；

所述金属螯合剂为琥珀酰亚胺-四氮杂环十二烷四乙酸；

所述金属离子为Ti⁴⁺、Zr⁴⁺或Sn⁴⁺。

3.权利要求1或2所述方法制备的表面螯合金属离子的磁性纳米材料。

4.权利要求3所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料在下述1)或2)或3)中的应用：

1)提取尿液中外泌体；

2)尿液中外泌体蛋白质组学分析；

3)尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析。

5.一种尿液中外泌体的提取方法，包括如下步骤：

向尿液中加入碱式磷酸酶进行酶解，然后经浓缩得到浓缩尿液；向所述浓缩尿液中加入权利要求3所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，进行孵育；然后通过磁铁分离，所述尿液中外泌体进入沉淀中，收集沉淀即可。

6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于：在所述酶解之前，所述方法还包括对所述尿液进行梯度低速离心和/或滤膜过滤饼的步骤；

所述碱式磷酸酶与所述尿液的配比为：1U：1mL～10mL；

所述尿液与所述浓缩尿液的配比为：10mL：0.1～1mL；

所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料与所述浓缩尿液的配比为10mg：0.1～1mL。

7.根据权利要求5或6所述的提取方法，其特征在于：所述方法还包括采用洗脱液洗涤所述沉淀得到所述外泌体的步骤，所述洗脱液为3％～20％的氨水。

所述洗涤步骤之后，采用PBS缓冲液洗涤所述沉淀。

8.一种尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：

采用权利要求5-7中任一项所述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体；通过磁铁分离，收集上清液，向所述上清液中加入尿素和二硫苏糖醇进行孵育，然后加入碘乙酰胺进行反应；所述反应结束后加入胰蛋白酶进行酶切，对所得反应液进行用液相色谱串联质谱分析，即可实现对所述外泌体蛋白质组学的分析。

9.一种尿液中外泌体磷酸化蛋白质组学分析的方法，包括如下步骤：

采用权利要求57中任一项所述的方法提取尿液中外泌体；采用裂解液裂解所述外泌体，加入二硫苏糖醇和碘乙酰胺进行孵育，然后加入胰蛋白酶进行酶切，所述酶切结束后，加入乙腈和三氟乙酸进行孵育，所述孵育结束后，通过磁铁分离吸附有磷酸肽的所述表面螯合金属离子的磁性纳米材料，实现对所述外泌体中磷酸化肽段的选择性富集，经洗脱液洗脱吸附的所述磷酸肽后，采用液相色谱串联质谱进行分析，即可实现对所述外泌体磷酸化蛋白质组学的分析。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述裂解液为SDS裂解液、尿素或RIPA裂解液。