[发明专利]四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列及其筛选方法

权利要求书

1.四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列，其特征在于：每个寡核苷酸序列的两端为固定序列，中间序列按照5'-3'的顺序排列如下：

第一组包含两条序列：

H1：TGCTCCTACTGACCACCCCGGCT

H21：CTTCCCCCTGTTCTGGCCCTGCA

第二组包含五条序列，分别为：

H5：TCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCTGA

H6：TCCTTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCTGA

H26：TCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCATGA

H38：TCCCTCTTGTGCTCCTTCTTGTGCAGCCTGA

H33：TTCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCTGA；

第三组包含三条序列，分别为：

H12：TCCCTCTGGGGTCTCCCTCTTGTGCAGCCTGA

H25：TCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCTGAG

H42：TCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCAGCCTTGA

第四组包含一条序列，为：

H28：CTCCCTCTTGTGCTCCCTCTTGTGCCTTCCCCCTGTTCTGGCCCTGCA

所述的每组中的任意一条寡核苷酸序列作为核酸适配体的中间序列用于鳗弧菌的识别鉴定。

2.根据权利要求1所述的四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列，其特征在于：所述两端固定序列为5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--中间序列--GCA CAA GAG GGAGAC CCC AGA GGG-3'。

3.根据权利要求1所述的四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列的筛选方法，其特征在于：所述筛选方法基于SELEX筛选技术的改进，具体如下：

（1）合成随机寡核苷酸文库：设计两端为固定序列，中间为35个随机碱基序列的寡核苷酸文库；

（2）结合：随机文库与靶目标在一定条件下结合一段时间；

（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；

（4）PCR扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行PCR扩增，获得可用于下一轮筛选的寡核苷酸文库，所述文库一部分用于后续步骤（5）的高通量测序，一部分用于步骤（6）的重复循环筛选；

（5）高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现频率大于或等于2次的寡核苷酸序列，即多拷贝序列作为候选序列，获得第一轮SELEX筛选的候选序列；

（6）重复循环筛选：选取步骤（4）扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标在一定条件下结合，重复结合、分离、PCR扩增、高通量测序、序列分析步骤，获得第2轮筛选的候选序列；重复循环n次，获得n轮筛选的的候选序列；

（7）序列分析：从第2轮开始，对步骤（6）筛选获得的1，2……n轮的候选序列进行比对分析，对所有重复的序列出现的频率进行统计；

（8）亲和特异性验证：根据步骤（7）序列分析挑选出的各频率序列进行合成，后与靶目标及其它对照菌结合进行亲和特异性的验证，根据亲和特异性效果筛选出所需寡核苷酸序列，即核酸适配体。

4.根据权利要求3所述的四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列的筛选方法，其特征在于：步骤（1）所述随机文库序列为5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC--N35--GCACAA GAG GGA GAC CCC AGA GGG-3'，步骤（4）所述的PCR的引物包括引物P1与P2，P1序列为5'-TCA GTC GCT TCG CCG TCT CCT TC-3'，P2序列为：5'-CCC TCT GGG GTC TCC CTC TTGTGC-3'。

5.根据权利要求3所述的四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列的筛选方法，其特征在于：所述靶目标为鳗弧菌。

6.根据权利要求3所述的四组用于鳗弧菌识别鉴定的寡核苷酸序列的筛选方法，其特征在于：步骤（6）所述的n≥2。