[发明专利]一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法

说明书

本发明公开了一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法，在SELEX筛选方法基础上，结合高通量测序技术，对每轮SELEX筛选出的寡核苷酸文库都进行高通量测序，通过统计分析每个随机文库对应的高频序列数，进而对随机文库的随机序列进行增减，并通过循环逼近法最终获得最短的适配体序列。通过构建不同的筛选文库，采用高通量测序逼近的方法来获得极短序列的核酸适配体，省去了后期截短加工和改造的麻烦。

技术领域

本发明涉及寡核苷酸序列、核酸适配体序列，尤其是涉及能获得较短序列核酸适配体的筛选技术。

背景技术

指数富集配体进化技术（Systemic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment），简称SELEX技术，是近年来新发展起来的一种系统筛选技术。它利用寡核苷酸分子可在空间形成多种多样的三维结构，通过构建的随机寡核苷酸库，从中筛选出与目标靶分子有特异识别作用的高亲和力的寡核苷酸分子——核酸适配体，其分子识别能力可达到甚至超过了单克隆抗体的水平，而制备技术则比单克隆抗体简单、快速。运用该技术目前已筛选出肿瘤细胞、炭疽杆菌等的核酸适配体，可用于肿瘤细胞和炭疽杆菌的检测、识别。

然而，很多情况下筛选获得的核酸适配体都并不令人满意，通常核酸适配体长度太长，导致合成成本较高，另外，过长的核酸适配体中非必要的序列较多，也会使检测过程中容易出现一些副反应和干扰因素。因此，不少人都对获得的核酸适配体进行截短加工和修饰，以期获得序列更短、亲和力较好的适配体。不过有关的截短加工的效果大多情况下并不理想。

现有技术也缺少一种直接筛选出最短序列核酸适配体的方法，以省去后续对过长核酸适配体序列进行的截短加工操作的麻烦。

发明内容

本发明的目的在于提供一种获得较短序列核酸适配体的SELEX筛选方法，该方法在筛选时对核酸适配体的序列长度进行了优化控制，使其尽量少，避免了后续的加工改造和截短的麻烦，且容易实现自动化操作，本发明具体内容如下：

一种筛选获得极短序列核酸适配体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）合成随机寡核苷酸文库：合成一个两端有固定序列、中间为随机序列的随机寡核苷酸文库，两端固定序列用于与引物结合进行PCR扩增；中间随机序列碱基数目为N，5≤N≤35，N为正整数；

（2）结合：将随机寡核苷酸文库与靶目标相结合；

（3）分离：分离出与靶目标结合的寡核苷酸；

（4）PCR扩增：对分离出的能与靶目标结合的寡核苷酸进行PCR扩增，PCR产物一部分用作下一轮筛选的寡核苷酸文库，另一部分用于后续第（5）步的高通量测序；

（5）高通量测序：对PCR扩增出的寡核苷酸文库进行高通量测序，选择出现次数或频率大于或等于2次的非引物序列的高频寡核苷酸序列，即为第1轮SELEX筛选的候选序列；

（6）重复循环筛选：选择第4步扩增出的寡核苷酸文库，与靶目标结合，重复步骤（2）-（5），获得第2轮SELEX筛选的的候选序列；重复循环m次(1≤m≤10)，获得m轮的SELEX筛选的候选序列；统计第1轮到第m轮的候选序列的数量，用k表示累计获得的高频的候选序列数量；

当筛选过程中出现下列情形时，

①如果初始随机文库中的中间随机序列数量为N，当重复筛选的循环数m满足条件1≤m≤10，且候选序列的数量k满足条件0≤k<5时，继续进行m+1轮的筛选，即重复步骤（2）—（6）的进行循环筛选；

②如果初始随机文库中随机序列数量为N，当循环数m满足1≤m≤10，且高频序列的数量k≥5时，停止筛选；重新合成中间随机序列数为N-1的初始随机文库，以该初始随机文库为起点，按步骤（2）—（6）进行新的SELEX筛选；