[发明专利]一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法

说明书

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。本发明将TGF‑β1、EGF和G‑CSF添加入基础培养基，作为肌腱干细胞成脂肪分化的诱导培养液。提高了肌腱干细胞向脂肪细胞分化的数量并缩短分化的时间。实验表明，以本发明提供的培养液诱导肌腱干细胞，能够在21天内即出现脂肪细胞的特性，细胞形态发生改变且油红O染色细胞数目增多。诱导28天后，细胞形态逐渐改变，呈多角形，细胞间质内含有矿盐沉积的钙化结节，油红O染色呈阳性。

技术领域

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

背景技术

肌腱病在高运动量的人群中常见，以局部疼痛、肿胀、功能障碍为临床特征，常见发病部位为肩袖、岗上肌、髌腱及跟腱。目前肌腱病的发病机制尚未完全研究清楚，对肌腱病的治疗方法有限，疗效不明确，这与对该病病理机制缺乏深入了解有关。

2007年美国学者从人和兔的肌腱中分离出一种具有自我更新能力的细胞，将其命名为肌腱干细胞或祖细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)。2010年香港学者从鼠肌腱中也分离出肌腱干细胞。该细胞具有多向分化潜能，并且在外源性前列腺素E2作用下异常分化。

目前，有学者提出肌腱干细胞的异常分化可能是肌腱病的发病基础，但目前对肌腱干细胞的分化机制尚未研究清楚。为了了解慢性腱病组织病理学变化提供细胞生物学依据，也为慢性腱病的临床治疗提供新思路，应当进一步研究肌腱干细胞的分化机制，开发肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种培养基及其应用和诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的方法。

本发明提供的培养基包括基础培养基、TGF-β1、EGF和G-CSF。

转化生长因子-β(Transforming growth factor beta,TGF-β)是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子-β属于转化生长因子-β超家族蛋白。转化生长因子-β可以结合到细胞表面的转化生长因子-β受体结合而激活其受体。本发明中，所述TGF-β1的浓度100ng/ml～200ng/ml。一些具体实施例中，所述TGF-β1的浓度为100ng/ml或200ng/ml。

粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种糖蛋白，含有174个氨基酸，分子量约为20000。G-CSF主要作用于中性粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)作用于造血祖细胞，促进其增殖和分化，其重要作用是刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能。本发明中，所述G-CSF的浓度10ng/ml～20ng/ml。一些具体实施例中，所述G-CSF的浓度为10ng/ml或20ng/ml。

表皮细胞生长因子(EGF)，又名人寡肽-1，是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活性多肽，藉由刺激表皮细胞生长因子受体之酪氨酸磷酸化，达到修补增生肌肤表层细胞，据说对受伤、受损之表皮肌肤拥有绝佳之疗效。其最大特点是能够促进细胞的增殖分化，从而以新生的细胞代替衰老和死亡的细胞。EGF还能止血，并具有加速皮肤和粘膜创伤愈合，消炎镇痛，防止溃疡的功效。EGF的稳定性能极好，在常温下不易失散流动，能与人体内各种酶形成良好的协调效应。最初的EGF主要被运用于医学领域，主要用于促进受损表皮的修复与再生，如治疗烧伤、烫伤等。本发明中，所述EGF的浓度10ng/ml～20ng/ml。一些具体实施例中，所述EGF的浓度为10ng/ml或20ng/ml。

本发明中，所述基础培养基为DMEM培养液。

一个具体实施例中，培养基包括：TGF-β1 100ng/ml、EGF 10ng/ml、G-CSF10ng/ml、DMEM培养基。