[发明专利]松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒

说明书

本发明公开了松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒。本发明以松材线虫的Bx‑tlp‑1基因为靶标设计了多对引物，经过筛选发现SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对扩增松材线虫和拟松材线虫DNA，结果松材线虫有特异性片段，该片段大小为755bp，而拟松材线虫无特异性片段；本发明进一步利用该特异性引物对扩增野外采集的媒介天牛组织DNA，结果扩增出松材线虫的特异性片段。本发明所筛选出的PCR特异性引物对具有良好的特异性和灵敏度，能够准确的检测媒介天牛是否携带松材线虫，并在野外对媒介天牛实现快速检测。

技术领域

本发明涉及松材线虫的检测方法，尤其涉及检测松材线虫的特异性PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒，属于松材线虫的分子检测领域。

背景技术

松材线虫病(Pine wilt disease)是由松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(SteinerBuhrer)Nickle]引起(Nickle et al.,1981)，可危害包括松属(Pinus spp.)、落叶松属(Larix spp.)、云杉属(Picea spp.)、黄杉属(Pseudotsuga spp.)、冷杉属(Abiesspp.)和雪松属(Cedrus spp.)在内的37种松属植物和8种非松属植物，其中以松属植物为最主要的寄主(张志诚,牛海山,黄保续等.基于GIS的中国松树萎蔫病发生的适应性评价[J].兰州大学学报(自然科学版),2005,41(5):27-32)。

研究发现，松材线虫致病过程中可能会分泌一些致病因子干扰或模拟松树次生代谢，诱导松树体内超量积累萜烯等次生代谢产物，最后导致松树自杀式死亡。在这一过程中，线虫分泌的某些能干扰植物防御反应的功能因子也可能是致病相关因子之一。Shinya(Shinya.,et al.,Secretome analysis of the pine wood nematode Bursaphelenchusxylophilus reveals the tangled roots of parasitism and its potential formolecular mimicry.Plos One,2013.8(6):p.e67377-e67377.)报道了在松材线虫分泌蛋白中鉴定出3条分子模拟蛋白，包括2条类甜蛋白(thaumatin-like proteins,TLPs)、1条类半胱氨酸蛋白酶抑制剂。同时，与线虫类甜蛋白相比，松材线虫类甜蛋白与松树(松属)类甜蛋白同源性更高。前期研究已克隆了松材线虫类甜蛋白(TLP-1)基因，与松材线虫全基因组中的类甜蛋白基因相似度为98.9％，序列NCBI比对结果显示该基因与西部白松类甜蛋白(TLP-S3:ADB97933.1)最为相似，氨基酸序列比对以及蛋白二级和三级结构预测分析结果显示，松材线虫类甜蛋白相对于动物源类甜蛋白，其结构与植物源类甜蛋白较为相似(汪菊,韩珊,理永霞,等.2014.松材线虫类甜蛋白(TLP-1)基因克隆及蛋白质结构预测.四川农业大学学报,32(3):305-310.Meng,F.L.,Wang,J.,Wang,X.,Li,Y.X.,and Zhang,X.Y.2017.Expression analysis of thaumatin-like proteins from Bursaphelenchusxylophilus and Pinus massoniana.PhysiologicalMolecular Plant Pathology 100:178-184.)。

松墨天牛是松材线虫病最重要的传播媒介，携带的是松材线虫幼虫，且携带的线虫有多种(徐福元，席客，杨宝君，葛明宏，孙永春.南京地区松褐天牛成虫发生、补充营养和防治[J].林业科学研究,1994,(2):215-218)，难以根据形态学特征来区分和鉴定松材线虫幼虫。准确诊断松墨天牛携带的松材线虫是监测松材线虫病发生蔓延过程中急需解决的难题。