[发明专利]一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法

说明书

本发明属于代谢产物提取技术领域，公开了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，利用HP‑20树脂柱洗脱发酵液、硅胶柱和Sephadex LH‑20凝胶柱层析分离、(半)制备高效液相分析与纯化化合物；运用现代仪器波谱分析技术如核磁共振、高分辨质谱等对单体化合物进行结构鉴定。本发明将从土样中分离得到的具有抗菌及抗肿瘤细胞活性的放线菌进行发酵，对其产生的代谢产物和部分产物生物活性进行归纳研究，丰富了微生物化合物多样性；为其他放线菌产活性物质的研究与发掘提供了参考与理论基础；同时，也为探索开发活性天然化合物及商业用药提供了前提。

技术领域

本发明属于代谢产物提取技术领域，尤其涉及一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法。

背景技术

目前，最接近的现有技术：

由于抗生素的滥用以及抗药性菌株的不断出现，以及临床上使用的抗癌药及抗生素60％～70％均出自或来源于其前体天然产物，使得人们一直致力于发掘寻找新型活性物质，而放线菌是公认的产生活性物质微生物中最大的类群，也是研究较多的一类，但由于研究手段和方法的限制，分离到的放线菌仅占土壤中所有放线菌的10％。其中产生物活性物质尤其是抗生素的链霉菌占了众多放线菌的一半，且广泛应用于医药和农业领域，然而不同菌株在产化合物上有所差异。一直以来从具有抗菌抗肿瘤活性放线菌中发现具有结构新颖的化合物屡见不鲜。

综上所述，现有技术存在的问题是：从微生物中分离结构新颖的活性化合物越来越难，亟需开发能够更快更准备分离鉴定新颖化合物的方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，探索与研究具有结构新颖的天然产物，为研发新型的、种类更多的前导药物提供可靠参考与依据，本发明提供了一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法。

本发明是这样实现的，一种链霉菌的次级代谢产物的分离提取方法，包括以下步骤：

步骤一，发酵培养：按接种量5％(V/V)，将培养24–48h种子培养基接种到20L摇瓶发酵的发酵培养基；装量为250mL/1L摇瓶，28℃，250rpm摇瓶发酵培养7d。

步骤二，将发酵后的20L发酵液通过真空抽滤，使得菌丝体和上清液分离，分开后的菌体用3L去离子水冲洗；再用3L乙醇室温搅拌浸泡12h后离心，取上清液。

步骤三，将HP-20树脂装入树脂柱，上清液加入到HP-20树脂柱进行动态吸附2次；吸附后用5L去离子水去除树脂上多余糖分，6L乙醇洗脱树脂，得到乙醇洗脱液。

步骤四，浸提液和乙醇洗脱液分别在55℃下浓缩至干；取浓缩样品少量溶解，TLC薄层层析；将两份浓缩样混合在一起，得到总发酵粗提取膏体24.6g。

步骤五，将步骤四所得发酵粗提物经100-200目硅胶柱层析，以氯仿/甲醇梯度洗脱，TLC薄层层析检测。

步骤六，将相似流份合并浓缩后，进行LH-20凝胶柱层析，以甲醇/氯仿进行洗脱，经TLC薄层层析检测，再浓缩。

步骤七，样品通过制备高效液相、半制备高效液相反向色谱进行化合物分离纯化，得7个化合物。

进一步，所述步骤一种子培养基组分及pH包括：Yeast Extract 0.4％，MaltExtract 1.0％，葡萄糖0.4％，可溶性淀粉2.0％，ISP3/ISP4微液1.0ml/L，CaCO₃0.2％，pH7.2-7.4。

进一步，所述发酵培养基组分及pH包括：可溶性淀粉2％，棉籽饼粉1％，YeastExtract 0.5％，麦芽糊精2.0％，Malt Extract 0.5％，CaCO₃ 0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.2％，NaCl 0.2％，pH 7.0-7.2。