[发明专利]一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法

权利要求书

1.一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的氢醌的胚胎毒性的检测方法步骤如下：

S1小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的制备：处死孕期小鼠，无菌条件下取出小鼠胚胎，从胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞，将所述的鼠胚胎成纤维细胞接种于培养瓶中培养、扩增，经过γ射线照射，冻存于液氮中，置于6孔板中保存备用；

S2小鼠胚胎干细胞的培养：从液氮中取出小鼠ES-E14TG2a复苏，接种于步骤S1中已铺好成纤维细胞饲养层的6孔板中，采用ESC常规培养基进行培养；

2~3ｄ后，小鼠胚胎干细胞克隆达60~70%融合时传代；

S3氢醌对小鼠胚胎干细胞的毒性作用：将氢醌从1mg/mL开始，依次按1:10进行梯度稀释，设7个检测浓度，分别进行细胞毒性和分化抑制实验，获得各个试验的检测终点，对小鼠胚胎干细胞进行毒性评价。

2.根据权利要求1所述的一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的步骤S1中孕期小鼠的孕期为12~13天，所述的小鼠为8~10周龄的昆明小鼠，所述的成纤维细胞接种于面积为70~80cm²的培养瓶中，所述的γ射线的辐射剂量为30~40Gy。

3.根据权利要求1所述的一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的步骤S2中的ESC常规培养基是由H-DEME基础培养基作为基础液，然后往基础液中添加10wt%的胎牛血清、1wt%的双抗、2mmol/L的谷氨酰胺、1wt%的非必需氨基酸和0.1mmol/L疏基乙醇。

4.根据权利要求3所述的一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的双抗为50U/mL的青霉素和50μg/mL链霉素的混合物。

5.根据权利要求1所述的一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的步骤S3细胞毒性试验为：将小鼠胚胎干细胞跟3T3细胞按细胞密度1×10⁴/mL接种于96孔板，进行孵育培养，然后将其置于含有氢醌的培养基中培养，于第10天用相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞活性，绘制出浓度活性曲线，计算出氢醌对小鼠胚胎干细胞的半数生长抑制浓度IC₅₀值。

6.根据权利要求1所述的一种利用胚胎干细胞实验模型检测氢醌的胚胎毒性方法，其特征在于：所述的步骤S3分化抑制实验为：将氢醌溶解于小鼠胚胎干细胞分化培养基，然后稀释成7个浓度梯度的检测培养液，用胰酶消化小鼠胚胎干细胞，然后置于培养箱中培养10天，10天后，光镜下观察并计数每个培养基含有心肌细胞搏动的孔数，绘制浓度活性曲线，计算出半数分化抑制浓度ID₅₀值。