[发明专利]一种EV71病毒核酸质粒及其构建方法及应用

说明书

本发明公开了一种EV71病毒核酸质粒，其中所述EV71病毒核酸质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。本发明还提供了所述EV71病毒核酸质粒的构建方法，该病毒核酸质粒能够在肿瘤细胞中包装出活体病毒并引发肿瘤细胞的凋亡。本发明还提供了所述EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。本发明的EV71病毒核酸质粒通过运载工具能够进入到肿瘤细胞中包装出活体病毒，引发肿瘤细胞的凋亡，有效提高病毒溶瘤的功能。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种EV71病毒核酸质粒，以及该EV71病毒核酸质粒的构建方法，以及该EV71病毒核酸质粒用于制备抑制实体瘤药物的用途。

背景技术

目前，大多数癌症治疗采用传统的手术、放疗、化疗方法，传统的癌症治疗技术存在副作用大的缺点，严重影响了癌症患者的生存质量。特别是当患者发展到癌症的中晚期时，传统的治疗技术效果不明显，预后较差，严重的副作用也影响到患者的生存质量。目前治疗癌症采用了免疫节点技术，取得一定的治疗效果。副作用小，在PD-1和PD-L1蛋白高表达的肿瘤患者中有效率可以达到50％，有效改善了患者的生存质量。但是近年来开始发现很多的癌症患者对PD-1单抗药物产生耐药性，特别是用了1年以上的患者。总体而言，癌症疾病是一种进化性复杂性疾病，单一靠一种治疗方法是无法解决的。

溶瘤病毒发展多年，可以算是治疗肿瘤的新奇治疗的方法，该方法利用病毒直接凋亡肿瘤细胞的功能以及免疫刺激的作用。但是传统的溶瘤病毒治疗方法存在的一些瓶颈问题，比如免疫屏障、耐药等。由于人体天然的免疫屏障，溶瘤病毒一旦进入体内就会被机体的免疫物质所识别，比如抗病毒的中和抗体和各种免疫细胞，病毒在到达肿瘤细胞之前就会被中和抗体结合或者被免疫细胞所吞噬，只有极少量的病毒能够进入肿瘤细胞发挥功效。人体免疫系统大大降低了溶瘤病毒的功效。另外溶瘤病毒需要进入到肿瘤细胞中，必须借助肿瘤细胞上存在的受体蛋白。肿瘤细胞就是天生不断进化变异细胞，很快会进化出缺乏溶瘤病毒的受体蛋白的肿瘤细胞，此时溶瘤病毒就无法侵入这些变异的肿瘤细胞，从而产生耐药性。

发明内容

本发明的一个目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够使肿瘤细胞凋亡的EV71病毒核酸质粒。

本发明的另一个目的是提供所述EV71病毒核酸质粒的构建方法。

本发明的再一个目的是提供所述EV71病毒核酸质粒的应用。

为了实现以上目的，本发明提供了一种EV71病毒核酸质粒，其中所述EV71病毒核酸质粒质粒包括EV71病毒全长cDNA序列和真核表达质粒序列。此外，本发明还提供了所述EV71病毒核酸质粒的构建方法，该方法包括：提取EV71病毒RNA核酸，将所述EV71病毒RNA反转录为cDNA，然后再将EV71病毒cDNA全长序列利用同源重组的方法连接到真核质粒载体上，从而构建所述EV71病毒核酸质粒。

优选地，所述构建方法的具体步骤如下：

步骤1：提取EV71病毒的RNA；

步骤2：将EV71病毒的RNA反转录为cDNA；

步骤3：用EV71病毒引物扩增EV71病毒的cDNA片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的EV71病毒cDNA核酸片段；

步骤4：用真核表达质粒的引物扩增真核表达质粒的DNA片段，电泳扩增产物，然后回收扩增的真核表达质粒核酸片段；

步骤5：连接步骤3所得到的EV71病毒cDNA核酸片段和步骤4所得到的真核表达质粒核酸片段，将连接产物转化到感受态细菌中，得到转化细菌；

步骤6：将培养的转化细菌涂板到含有氨苄的LB琼脂板上，挑选单克隆细菌，筛选和鉴定连接成功的EV71病毒核酸质粒细菌。