[发明专利]一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法

说明书

本发明提供一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法，包括以下步骤：(1)病料样品处理，得到处理好的样品液；(2)样品接种：将处理好的样品液或用无菌的0.01MpH7.2PBS稀释得到的稀释后的样品液接种7‑8日龄健康SPF鸡胚，接种后，将SPF鸡胚置于孵化箱继续孵育，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％；(3)收获：观察鸡胚的存活情况，将接种后死亡鸡胚置4℃保存12‑24h，收集鸡胚尿囊液。本发明方法可方便、快速的用于山羊支原体山羊肺炎亚种的分离培养，可方便快速获得不含动物血清的山羊支原体山羊肺炎亚种抗原，可克服血清使用带来的诸多问题。

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法。

背景技术

山羊传染性胸膜肺炎，主要由山羊支原体山羊肺炎亚种引起，是OIE法定报告疫病。临床上主要表现为发烧、咳嗽、流鼻涕、呼吸困难等。在新发疫区往往具有发病率高和死亡率高特点，给养羊业带来严重威胁和经济损失。

山羊传染性胸膜肺炎目前主要在亚洲和非洲一些国家或地区流行，但病原分离报道很少，主要是由于山羊支原体山羊肺炎亚种对营养要求极高，难于培养，此外分离病料要求高。我国大部分省市养羊区域该病血清学阳性，但分离菌株却很少报道。

山羊支原体山羊肺炎亚种非常难于培养，该病原引起的疾病-山羊传染性胸膜肺炎最早于1873年发现，100多年后其病原山羊支原体山羊肺炎亚种才被分离出来。我国在上世纪20年代就有山羊传染性胸膜肺炎的报道，2007年哈尔滨兽医研究所首次分离出该病原，同年兰州兽医研究所实验室分离出该病原。山羊支原体山羊肺炎亚种难于培养很重要原因是没有适宜培养方法和培养基。目前，山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养最常用培养基为改良Thiaucourt's培养基(MTB培养基)。改良Hayflick’s培养基、改良KM2培养基等也被用于培养山羊支原体山羊肺炎亚种，培养滴度不及改良Thiaucourt's培养基。现有技术培养基成分复杂，含有碳源、氮源、蛋白质、无机盐等诸多营养组分，往往多达8～15种甚至更多，配制步骤繁琐，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题。此外，山羊支原体山羊肺炎亚种体外生长培养依赖一定浓度动物血清，现有技术培养基中血清含量通常为10％～25％之间，低血清高效培养基为该病疫苗研发奠定了良好基础。血清来源、质量和批次容易导致培养基批间差异较大、成本高等问题，此外，含血清抗原存在易增加副反应影响免疫效果、生物安全等问题。

鸡胚通常被用来分离新城疫病毒、流感病毒等。目前，国内外尚未见到用鸡胚培养法分离培养山羊支原体山羊肺炎亚种研究报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法。

本发明提供一种山羊支原体山羊肺炎亚种分离培养方法，包括以下步骤：

(1)病料样品处理，得到处理好的样品液；

(2)样品接种：将处理好的样品液或用无菌的0.01M pH7.2 PBS稀释得到的稀释后的样品液接种7-8日龄健康SPF鸡胚，接种后，将SPF鸡胚置于孵化箱继续孵育，孵化箱温度37.0～37.5℃，湿度50％；

(3)收获：观察鸡胚的存活情况，将接种后死亡鸡胚置4℃保存12-24h，收集鸡胚尿囊液。

作为优选，步骤(1)中，所述病料样品为发病死亡山羊的新鲜病料胸水或肺泡灌洗液。

作为优选，步骤(1)中，所述病料样品处理是将发病死亡山羊的新鲜病料胸水或肺泡灌洗液用0.45μm滤膜的无菌滤器过滤，对滤过样品液进行灭菌。

作为优选，步骤(2)中，所述接种为卵黄囊接种，接种量为每枚鸡胚接种0.2ml。

作为优选，步骤(2)中，所述健康SPF鸡胚的标准为：血管清晰、鸡胚活力旺盛。