[发明专利]高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌及其构建方法及应用有效
| 申请号： | 201910833893.0 | 申请日： | 2019-09-04 |
| 公开（公告）号： | CN110527656B | 公开（公告）日： | 2021-07-20 |
| 发明（设计）人： | 刘龙;顾刘燕;刘克;堵国成;李江华;陈坚 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12P17/12;C12R1/19 |
| 代理公司： | 苏州市中南伟业知识产权代理事务所(普通合伙) 32257 | 代理人： | 冯瑞 |
| 地址： | 214122 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 高效 合成 甲基 羧酸 工程 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的工程菌以大肠杆菌为宿主，重组表达了二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶，编码所述的二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶的基因分别位于三个基因载体上；
所述的工程菌还强化表达了二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因；
所述的强化表达二甲苯单加氧酶的电子转移蛋白基因是通过将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点由SEQ ID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列；
所述的二甲苯单加氧酶以pETDuet-1为基因载体，所述的苯甲醇脱氢酶以pRSFDuet-1为基因载体，所述的苯甲醛脱氢酶以pCDFDuet-1为基因载体。
2.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌，其特征在于，编码所述的二甲苯单加氧酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述的苯甲醇脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码所述的苯甲醛脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种构建权利要求1-3任一项所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）以pETDuet-1、 pRSFDuet-1、pCDFDuet-1为基因载体，分别构建包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒，其中，所述的二甲苯单加氧酶以pETDuet-1为基因载体，所述的苯甲醇脱氢酶以pRSFDuet-1为基因载体，所述的苯甲醛脱氢酶以pCDFDuet-1为基因载体；
（2）将分别包含二甲苯单加氧酶、苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到所述的工程菌；
所述的方法还包括将连接二甲苯单加氧酶基因的重组质粒的核糖体结合位点由SEQID NO.9所述的序列替换为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示的序列的步骤。
5.一种权利要求1-3任一项所述的高效合成5-甲基吡嗪-2-羧酸的工程菌的应用，其特征在于，应用所述的工程菌催化2,5-二甲基吡嗪合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用具体是将所述的工程菌在28-30oC下，以0.05-0.5 mM的IPTG进行诱导8-12h，离心收集细胞，加入4-12g/L底物2,5-二甲基吡嗪，催化36-48h合成5-甲基吡嗪-2-羧酸。
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