[发明专利]一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用有效
| 申请号： | 201910834176.X | 申请日： | 2019-09-04 |
| 公开（公告）号： | CN111139208B | 公开（公告）日： | 2022-07-26 |
| 发明（设计）人： | 刘清术;陈武;黎定军;张亮;雷平;郭照辉;黄军 | 申请（专利权）人： | 湖南省微生物研究院 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74;C12P21/02;C07K7/02;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京润平知识产权代理有限公司 11283 | 代理人： | 王崇 |
| 地址： | 410009 湖*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 菌素 高产 工程 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种伊短菌素高产工程菌，其特征在于，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。
2.一种伊短菌素高产工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp与抗性基因ApraR连接，获得ApraR-Pmwp融合片段，构建同源重组整合载体，利用同源重组技术将野生型短短芽孢杆菌X23中伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp，得到一种短短芽孢杆菌工程菌，该菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2019681。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述抗性基因ApraR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
所述伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述同源重组整合载体以载体pE194为出发载体，与所述ApraR-Pmwp融合片段及Ede簇操纵子中天然启动子区的上、下游同源序列片段构建得到同源重组整合载体pBR322-ErmB-194ori-edePC-ApraR-Pmwp；
所述同源重组技术包括将所述同源重组整合载体导入野生型短短芽孢杆菌X23中，将伊短菌素生物合成基因簇的原始启动子Pede替换为短短芽孢杆菌的中层细胞壁蛋白基因启动子Pmwp；
其中，Ede簇操纵子中天然启动子区的上游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
Ede簇操纵子中天然启动子区的下游同源序列片段核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，还包括对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行鉴定，所述鉴定的过程包括以抗性基因ApraR的引物为探针对利用同源重组技术处理后的短短芽孢杆菌进行菌液PCR检测，其中，所述抗性基因ApraR的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7所示。
6.一种伊短菌素的制备方法，其特征在于，该方法包括将伊短菌素高产工程菌发酵制得，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述伊短菌素高产工程菌发酵包括将伊短菌素高产工程菌活化后，接种于NB液体培养基中进行发酵。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括将所述发酵得到的发酵液上清液进行阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱后，经旋转蒸发后，再进行高效液相色谱分离后得到所述伊短菌素。
9.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有伊短菌素高产工程菌，所述工程菌为短短芽孢杆菌工程菌，保藏编号为CCTCC NO：M2019681。
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