[发明专利]一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用

说明书

本发明公开了一种碱性果胶酶Pel3‑磷酸铜杂化纳米花及其应用，属于酶工程技术领域。其由碱性果胶酶Pel3与Cusubgt;3/subgt;(POsubgt;4/subgt;)subgt;2/subgt;共结晶形成的杂化纳米花，所述杂化纳米花的粒径小于20μm。该纳米花最适反应温度为55℃，最适pH 9，热稳定性有显著提高，重复利用四次后残余相对酶活在50％以上。其良好的热稳定性和可重复利用性在生产健康产品聚半乳糖醛酸寡糖、纺织、饲料上有非常好的商业化生产前景。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体而言，涉及一种碱性果胶酶-无机杂化纳米花，尤其涉及一种热稳定性提高的碱性果胶酶-无机杂化纳米花及其应用。

背景技术

果胶是一种广泛分布于植物果实、根、茎、叶中的多糖类高分子化合物，是植物细胞壁的组成成分，伴随着纤维素而存在，构成相邻细胞中间层黏结物，用于黏结植物组织。果胶主要由半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接成长链，分子量在10-400kDa之间，其水解产物聚半乳糖醛酸寡糖对动植物具有良好的生物活性。寡聚半乳糖醛酸能诱导植物防御，对烟草花叶病毒、小麦白粉病、苹果花叶病、玉米大斑病、棉花黄萎等植物疾病有良好的抗性作用，还能活化、促进益生菌双歧杆菌的生长，对维护肠道菌群平衡，抑制有害肠菌，合成各类微量元素，治疗便秘，腹泻等疾病，助消化，降低胆固醇，预防高血压，增强机体抵抗力等具有良好的促进作用。另外，在纺织工业生产中，生物催化可以替代传统化学试剂实现绿色制造及降低生产成本。高活性、热稳定性良好的碱性果胶裂解酶(Pels)用于纺织品加工的煮练和苎麻脱胶工艺能够带来巨大的经济效益。

目前，获得聚半乳糖醛酸寡糖的方法主要有三种：天然原料中提取，化学合成和天然多糖水解。然而，天然植物中聚半乳糖醛酸寡糖含量极低，分离难度大且纯度低，不适宜大量制备；化学合成具有立体选择性不可控、产率低、副反应多等缺点，酶法合成中用到的糖苷合成酶价格昂贵，也不适用于商业化生产。多糖水解分为化学法和酶法，化学法是利用强酸强碱等水解果胶，其降解速度较快，可控性差，极易得到单糖而不易得到寡糖，因此降解产物复杂，均一性差，引入的化学试剂使得寡糖的分离纯化过程复杂化，产率低。酶法水解果胶的反应条件温和且特异性强，无副反应，反应过程可控，产物均一性好，具有良好的商业化生产前景。

果胶酶主要分为三类：果胶酯酶，果胶水解酶和果胶裂解酶。目前，已报道的果胶酶大部分来源于微生物。果胶裂解酶可将果胶解聚生成低聚半乳糖醛酸，分子量在25-45kDa，最适pH在7.5-10.0，最适温度在40-50℃。然而，现有的果胶酶由于酶活性和热稳定性达不到要求而阻碍了其在工业生产上的应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明通过对酶进行固定化处理，提供一种热稳定性提高的碱性果胶酶-磷酸铜杂化纳米花。

为了实现本发明的目的，本发明人选择益生菌枯草芽孢杆菌来源的碱性果胶酶PEL168经分子改造后比酶活和热稳定性均有所提高的突变体PelK47E V132F R272W(简称Pel3，其获取方法参见本发明人前期申报的专利CN 106085994 A)作为研究对象，通过有机-无机共沉淀的酶固定化方法，获得一种最适温度55℃、最适pH 9、热稳定性提高、重复利用四次后残余相对酶活在50％以上的碱性果胶酶-磷酸铜杂化纳米花。

具体地，本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种杂化纳米花，由碱性果胶酶Pel3与Cu₃(PO₄)₂共结晶形成的杂化纳米花，所述杂化纳米花的粒径小于20μm。

优选地，如上所述的杂化纳米花，其最适温度为55℃，最适pH为9，重复利用四次后残余相对酶活在50％以上。

本发明还提供了一种上述杂化纳米花的制备方法，该方法包括如下步骤：在磷酸盐缓冲液中加入终浓度为8mM的可溶性金属离子Cu²⁺，同时加入终浓度为0.02mg/mL的碱性果胶酶Pel3，摇匀后孵育，离心得沉淀，水洗，冷冻干燥，得杂化纳米花。