[发明专利]基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法

说明书

本发明公开一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，DNA序列如SEQ ID NO：1所示；上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；鉴定方法依次按照如下步骤进行：分离鱼体病灶部位组织提取组织DNA；进行PCR扩增；用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，若出现498 bp的电泳条带，病灶部位寄生的盾纤毛虫即为水滴伪康纤虫，具有快速、简单和准确等优点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法。

背景技术

水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembus persalinus）是盾纤毛虫的代表种，隶属于盾纤目，纤毛虫类，是个体微小的兼性寄生纤毛虫，已被公认为是海水养殖鱼类的主要盾纤类病原体。水滴伪康纤虫适应性极强，可自由生活于各种养殖水体中，一旦养殖水体中因残饵过多、环境恶化等导致有机物含量过高，水滴伪康纤虫将大量繁殖并寄生于各养殖周期鱼体，尤其是体表损伤的鱼体。该寄生虫以宿主的细胞或组织碎片为食，严重时患病鱼体继发细菌性疾病，导致养殖鱼类大量死亡。为此当虫害发生时，需要对寄生于宿主体表的虫子进行鉴定，以便根据不同种类准确施药。

然而，由于盾纤类寄生虫活体形态十分相似，在光学显微镜及扫描电镜下均难以区分（附图1、2、3、4），即使借助18S rDNA技术测定核糖体序列，因盾纤类的序列相似度相对较高（达到90%以上），使得盾纤毛虫定种难度较大。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记、引物及方法。

本发明的技术解决方案是：一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记，其特征在于DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的引物，其特征在于上游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示。

一种基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 取患病鱼体表盾纤毛虫寄生病灶部位组织提取DNA；

b. 按照下列条件进行PCR扩增：

PCR反应体系为40 μL体系：KOD buffer 20 μL， 2 mM dNTPs 8 μL，上游引物及下游引物各 2 μL，2 μL，KOD酶 0.8 μL，盾纤毛虫DNA 2 μL，灭菌蒸馏水5.2 μL；所述游引物及下游引物的DNA序列分别如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示；

PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min； 98 ℃变性15 s，56 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，35个循环；68 ℃延伸5 min；

c. 用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，若出现498 bp的电泳条带，所分离得到的盾纤毛虫即为水滴伪康纤虫。

本发明确定了基于PCR鉴定水滴伪康纤虫的分子标记并设计了鉴定引物，只需进行一次PCR扩增，即可准确地鉴定出盾纤毛虫的代表病原—水滴伪康纤虫，具有快速、简便及准确等优点。

附图说明

图1是水滴伪康纤虫在光学显微镜下观察结果。

图2是海洋尾丝虫在光学显微镜下观察结果。

图3是水滴伪康纤虫扫描电镜观察结果。

图4是海洋尾丝虫扫描电镜观察结果。

图5是本发明实施例以被测鱼体组织DNA为模板进行PCR扩增结果电泳图。

图6以海洋尾丝虫DNA和水滴伪康纤虫DNA为模板进行PCR扩增结果电泳图。