[发明专利]一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法

说明书

本发明涉及一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：1)制备包括核酸适配体的检测试剂，并对牛奶样品进行预处理；2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线；3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中，反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。与现有技术相比，本发明利用环丙氨嗪特异性核酸适配体控制合成具有拉曼效应的纳米银来进行环丙氨嗪检测，检测方法灵敏度高，选择性好，最低检测限为15.5ppb，操作简便，前处理简单，不需要大型仪器，成本低，可用于牛奶中环丙氨嗪的检测。

技术领域

本发明属于牛奶中环丙氨嗪检测技术领域，涉及一种利用环丙氨嗪核酸适配体控制合成具有拉曼效应的纳米银，并通过拉曼光谱仪检测牛奶中环丙氨嗪的方法。

背景技术

环丙氨嗪(Cyromazine，Cyr)的化学名为2-环丙胺基-4,6-二氨基三嗪，与阿特拉津、西玛津、莠灭津、扑灭津等同属三嗪类或均三氮苯化合物，是一种高效抑制昆虫生长剂、杀寄生虫类杀虫剂，在畜禽养殖过程中作为饲料添加剂使用。研究表明环丙氨嗪进入动物体内绝大部分以原药或代谢物形式通过奶或者粪尿排泄，随后再经由畜禽粪便暴露在土壤和水环境中。土壤或水环境中的环丙氨嗪通过环境转归再次进入食物链，对不同营养级生物和人体的健康造成潜在隐患。环丙氨嗪在动物和植物体内经脱烷基化作用代谢为三聚氰胺(Melamine，Mel)，而三聚氰胺的主要代谢产物为三聚氰酸(Cyanuric acid，CA)、三聚氰酸一酰胺(Ammelide，Amd)和三聚氰酸二酰胺(Ammeline，Amn)。长期摄入三聚氰胺会导致膀胱结石，使膀胱癌的发生率明显提高。

对牛奶中环丙氨嗪及其代谢产物的快速检测，可以有效避免有毒有害物质进入人体。环丙氨嗪及其代谢物三聚氰胺是一组分子量小、且极性强的化合物，要想将环丙氨嗪及其相关代谢物从实际样品中提取出来非常困难。美国EPA严格规定了环丙氨嗪必须作为饲料添加剂且只能放置在厩舍喂饲槽中使用，但仍有通过喷洒用于饲养场所、堆肥、垃圾等处的灭蝇。环丙氨嗪经动物口服后绝大部分以原药或代谢产物三聚氰胺形式经动物尿粪排泄，在动物体内残留很少。美国EPA和PRC制定了环丙氨嗪在一系列动植物食品中的最高残留标准，其中牛奶为0.05mg/kg。

根据环丙氨嗪及其代谢产物三聚氰胺在食品中的限量标准要求，目前常用于环丙氨嗪及其代谢产物残留检测的方法有容量分析法；色谱分析方法，包括高效液相色谱法；免疫化学分析法；光学分析法等。在GB 29704-2013中采用超高效液相色谱-串联质谱法来测定动物性食品中环丙氨嗪的残留。随着环丙氨嗪类兽药残留检测列入生乳收购及乳制品产品出厂必检项目，而由于上述检测方法和条件的限制，面对庞大的检测数量会导致成本巨大且工作量重，难以满足现场快速检测的需求，这就在客观上要求改进现有的检测方法，开发出高通量、快速、高灵敏的环丙氨嗪检测方法，用于日常监控。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于核酸适配体检测牛奶中环丙氨嗪的方法，该方法包括以下步骤：

1)制备包括核酸适配体的检测试剂，并对牛奶样品进行预处理；

2)绘制不同浓度的环丙氨嗪标准液与对应的拉曼强度的标准曲线；

3)将检测试剂加入至预处理后的牛奶样品中，反应后测定拉曼强度，并利用标准曲线得到牛奶样品中环丙氨嗪的含量数据。

进一步地，步骤1)中，所述的检测试剂包括核酸适配体溶液、硝酸银溶液及硼氢化钠溶液。检测试剂均为水溶液。

进一步地，所述的核酸适配体溶液中，核酸适配体序列为5’-CCCGGTTGGTTGGTTGGTTTTCCC-3’。