[发明专利]一种L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用

说明书

本发明提供一种L‑苏氨酸醛缩酶，具有将对甲砜基苯甲醛和甘氨酸不对称催化合成(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸的活性，L‑苏氨酸醛缩酶选择自下组中任意一种：(1)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的多肽；(2)具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列≥80％同源性的多肽；(3)将SEQ ID NO：1所示氨基酸序列经过1‑5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且保留催化活性的衍生多肽。本发明还提供L‑苏氨酸醛缩酶在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用，挖掘筛选到来源于Actinocorallia herbida的L‑苏氨酸醛缩酶基因，采用基因工程技术表达重组大肠杆菌来源的L‑苏氨酸醛缩酶，以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，采用全细胞催化的方法，不对称催化合成(2S,3R)‑对甲砜基苯丝氨酸，反应条件温和、对环境友好。

技术领域

本发明属于生物技术和化学工程领域，具体涉及一种L-苏氨酸醛缩酶及其在对甲砜基苯丝氨酸合成中的应用。

背景技术

β-羟基-α-氨基酸是β-氨基醇类抗生素甲砜霉素和氟苯尼考、糖肽类抗生素万古霉素、抗癌药物紫杉醇以及免疫抑制剂的重要组成成分。对甲砜基苯丝氨酸是β-氨基醇类广谱抗生素甲砜霉素和氟苯尼考合成的关键手性砌块，具有2个手性中心，可形成4种手性异构体，目前已报道的活性中间体几乎都是由(2S,3R)-构型组成。如何通过不对称催化高效构建其结构中的两个相邻手性中心，开发甲砜霉素和氟苯尼考的高效绿色合成新路线一直是有机合成化学研究的重点与难点。

目前，工业上合成甲砜霉素和氟苯尼考手性中间体主要采用基于拆分策略的合成路线。首先以对甲砜基苯甲醛和甘氨酸为原料，在硫酸铜以及氨水的作用下，在70℃条件下经羟醛缩合反应(aldol reaction)合成对甲砜基苯丝氨酸铜盐，并在氯化氢气体作用下，与无水乙醇进行酯化反应得到对甲砜基苯丝氨酸乙酯，再用D-酒石酸对反应混合物进行手性拆分，得到(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸乙酯，最后通过硼氢化钙的还原获得其对应的氨基醇。该路线在合成对甲砜基苯丝氨酸铜盐时会产生大量的硫酸铜废水，另外消旋体的拆分过程也会产生大量的废水，对环境污染严重；而且通过拆分分离单一异构体，目标产物理论产率最高只能达到50％。

相较于化学合成法，生物催化法具有转化条件温和、环境友好、立体选择性强等优点。苏氨酸醛缩酶(EC 4.1.2.5,TA)是磷酸吡哆醛(PLP)依赖型酶，能催化不同取代基的醛与甘氨酸进行羟醛缩合反应，直接形成不对称C-C键，从而得到β-羟基-α-氨基酸。根据产物在C_α的构型，可将TA分成L-TA(L-苏氨酸醛缩酶)和D-TA(D-苏氨酸醛缩酶)两种，L-TA催化的产物之一便是(2S,3R)-β-羟基-α-氨基酸，参见附图4所示。

目前国内外还未见到利用L-苏氨酸醛缩酶催化对甲砜基苯甲醛和甘氨酸合成(2S,3R)-对甲砜基苯丝氨酸的文章报道，涉及的相关专利申请文献只有1件：《苏氨酸醛缩酶、突变体及其在制备取代苯丝氨酸衍生物中的应用》(申请公布号CN 109402098 A)。但该发明申请公开了几种微生物来源的苏氨酸醛缩酶基因和氨基酸序列、突变体编码基因、几种异源表达方法(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母)；以及以苏氨酸醛缩酶或苏氨酸醛缩酶的突变体为催化剂，以2-/3-/4-位取代的苯甲醛为底物，以5-磷酸吡哆醛为辅酶，以甘氨酸/甘氨酸酯为辅底物，控制温度和搅拌速度的条件下，在反应介质里进行酶催化，制备2-/3-/4-位取代的苯丝酸衍生物。该专利申请涉及的内容繁多，但却缺乏具体的实验数据支撑，2张附图没有标品、不同手性的对甲砜基苯丝氨酸的出峰时间和构型说明，无法判断其ee值、de值和构型；而且该方案需要将成功重组后的大肠杆菌超声破碎并提取纯酶液作为催化剂，流程繁琐且成本很高。

综上所述，现在需要寻找一种β-氨基醇类抗生素手性中间体的不对称生物催化合成方法，解决现有技术中有机合成方法所存在的生产步骤繁琐、反应条件剧烈、生产成本高、环境污染大等技术瓶颈问题。

发明内容：