[发明专利]肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法

说明书

本发明涉及肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6‑os1转基因小鼠的培育方法，可有效解决在不同肾脏疾病中研究足细胞损伤的作用机制的问题，其解决的技术方案是，通过基因工程技术对前期建立的携带FLOX‑DLX6‑os1转基因小鼠与另一种携带足细胞特异的NPHS2‑Cre基因的转基因小鼠进行多代的繁殖杂交，实现肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6‑os1转基因小鼠的培育，本发明为明确lncRNA DLX6‑os1在足细胞损伤中的作用提供了非常好的动物模型，有效解决在不同肾脏疾病中研究足细胞损伤的作用机制的问题，是转基因小鼠的培育方法上的创新。

技术领域

本发明涉及医学生物，特别是一种肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法。

背景技术

肾脏的滤过功能对于维持机体正常的运转至关重要，其滤过功能的维持需要滤过屏障才能发挥。而滤过屏障中最重要的组分之一就是足细胞。足细胞的健康与否关系着肾脏功能乃至整个机体功能的正常维持。疾病状态下，如果足细胞受损，发生足细胞肥大、凋亡、或者足突融合均会导致足细胞的滤过功能下降，最直接的临床表现就是患者出现蛋白尿，而蛋白尿的出现将会加重整个肾脏的损伤，目前已发现多种肾脏病的发生发展关键之一就是足细胞损伤，如糖尿病肾病、IgA肾病、狼疮肾等。因此，维持足细胞的健康状态是减少肾脏疾病损害的关键。

前期的研究基础发现 LncRNA DLX6-AS1（DLX6 antisense RNA 1：RefSeq GeneID 285987，对应于小鼠的是Dlx6-os1）在糖尿病肾病、IgA肾病患者的肾组织中表达增多，尤其是在足细胞中的表达较正常对照组表达增多，进一步通过肾病动物模型和细胞模型进行验证，发现 DLX6-os1的表达水平与小鼠的尿蛋白的增加成正相关，和足细胞的损伤程度成正相关，进一步实验发现在正常足细胞中过表达lncRNA DLX6-os1可导致足细胞损伤、小鼠发生蛋白尿，说明lncRNA DLX6-os1与肾脏损伤、足细胞损伤密切相关，但具体的机制和作用不明。

为了进一步明确该lncRNA在足细胞中的重要作用，需要改变实验动物足细胞DLX6-os1的表达水平，目前国际普遍应用的方法是注射携带lncRNA的病毒到相应的组织器官，试图改变该lncRNA的表达水平，即使是使用足细胞特异表达的慢病毒载体，仍然存在较多问题：1.病毒的感染效率低，不能实现在特定细胞中有效改变lncRNA的表达水平的效果；2.有些lncRNA序列较长，不适合包装病毒或造成病毒的滴度低，不合适感染动物；3.在特异靶细胞中的效果较差。

因此，通过基因工程技术对前期建立的携带FLOX-DLX6-os1转基因小鼠进一步基因改造，发明了肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠（flox / flox，NPHS2-Cre）的培育方法，为明确lncRNA DLX6-os1在足细胞损伤中的作用提供了非常好的动物模型，有效解决在不同肾脏疾病中研究足细胞损伤的作用机制的问题，但至今未见有公开报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，可有效解决在不同肾脏疾病中研究足细胞损伤的作用机制的问题。

本发明解决的技术方案是，通过基因工程技术对前期建立的携带FLOX-DLX6-os1转基因小鼠与另一种携带足细胞特异的NPHS2- Cre基因的转基因小鼠进行多代的繁殖杂交，实现肾脏足细胞特异敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠（flox/flox，NPHS2- Cre）的培育，具体是：

1）基因动物打靶培育F0代：将Southern blot（印迹杂交）验证基因为阳性的ES细胞用于基因打靶，即将基因敲除质粒载体导入ES（胚胎干细胞）细胞中，通过显微注射到囊胚中，再移植到代孕母鼠的子宫内发育下一代，获得携带FLOX-DLX6-os1的首建鼠F0代；