[发明专利]一种肿瘤疫苗的制备方法及使用该方法制备的肿瘤疫苗

说明书

本发明公开了一种肿瘤疫苗的制备方法，将筛选得到的肿瘤抗原的基因序列克隆到病毒表达载体上，制备重组病毒，得到所述肿瘤疫苗；其中，在首个所述肿瘤抗原的基因序列的5’端插入如SEQIDNo.1所示的信号肽序列或与其具有80％以上同源性的序列，在末尾的所述肿瘤抗原的基因序列的3’端插入如SEQIDNo.2所示的MHC转运信号序列或与其具有80％以上同源性的序列；所述病毒表达载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒，优选为腺病毒。本发明利用特定的方法筛选出肿瘤抗原，利用病毒载体，特别是腺病毒载体表达并制备该肿瘤抗原的疫苗，该疫苗具有强大的免疫刺激活性，同时可降低对免疫佐剂的需求。

技术领域

本发明涉及细胞免疫治疗技术领域，特别涉及一种肿瘤疫苗的制备方法及使用该方法制备的肿瘤疫苗。

背景技术

肿瘤细胞具有基因组不稳定性以及体细胞突变快速积累的特征，基因组测序显示，肿瘤细胞具有高度的异质性，在肿瘤病人中可达到成百上千的体细胞突变，突变类型也呈多样化，包括点突变、插入缺失突变、基因扩增、基因重排等。有些突变可造成该基因编码蛋白的变异，突变的蛋白质可导致细胞增殖的失控，从而导致肿瘤发生。

癌症疫苗一直是肿瘤治疗领域的研究热点，但是在研究过程中有不少难点，比如抗原的选择、佐剂、传输方式等。个性化新抗原是一系列具有免疫原性的含有肿瘤细胞特异突变的肽段，因此，发现并验证新抗原是一项非常困难的工作，随着DNA测序技术以及生物信息技术的发展，让这项工作成为可能。Rosenberg等已经证明新抗原特异性T细胞在快速消灭肿瘤及保持患者长期生存起到重要作用，Schreiber等证明新抗原的表位展示可为免疫检查点抑制剂治疗提供靶点。直到2017年，两例临床试验的成果发表《自然》杂志上，该成果都采用了新抗原疫苗的治疗方式，研究表明，共有66.7％(4/6)和61.5％(8/13)例黑色素瘤患者在完成切除手术并接受疫苗治疗后，整个随访期间(分别为20-32个月和12-23个月)无复发，因此，个性化新抗原疫苗也成了新的研究热点。

个性化新抗原疫苗的筛选及制备过程较为复杂，首先收集患者的肿瘤细胞样品和正常细胞样品，采用外显子测序，通过比对肿瘤和正常细胞的测序数据，分析患者肿瘤细胞中特异的基因突变，包括非同义点突变、插入或缺失突变、基因融合等；通过对患者肿瘤细胞的RNA测序，筛选出可转录表达的突变基因；通过人工智能或者机器学习算法，预测这些候选抗原与人类白细胞抗原(HLA)的亲和力并进行排序，进一步筛选并决定使用哪些新抗原；新抗原疫苗的制备主要包含多肽合成和RNA疫苗，不同的制备方法也将影响免疫原性，制备好的新抗原疫苗注射到患者体内，被抗原呈递细胞(APC)捕获后呈递给CD8⁺或CD4⁺T细胞，最终产生抗肿瘤免疫反应。

目前有多种类型疫苗，较为普遍的为RNA疫苗和多肽，多肽疫苗主要缺点为生成费用高，并且个体化多肽的理化性质具有高度可变性，给生产带来困难。RNA疫苗主要缺点为容易发生降解。并且两者对免疫佐剂选择的要求也非常高，这些都限制了应用。

因此急需寻找一种具有强大的免疫刺激活性，同时可降低对免疫佐剂的需求的肿瘤抗原疫苗，来解决上述问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有技术中肿瘤疫苗免疫应答水平低，同时对佐剂依赖高的问题，提供了一种肿瘤抗原的制备方法及使用该方法制备的肿瘤抗原。

本发明提供的技术方案为：

一种肿瘤疫苗的制备方法，将筛选得到的肿瘤抗原的基因序列克隆到病毒表达载体上，制备重组病毒，得到所述肿瘤疫苗；

其中，在首个所述肿瘤抗原的基因序列的5’端插入如SEQIDNo.1所示的信号肽序列或与其具有80％以上同源性的序列，在末尾的所述肿瘤抗原的基因序列的3’端插入如SEQIDNo.2所示的MHC转运信号序列或与其具有80％以上同源性的序列；

所述病毒表达载体为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒，优选为腺病毒。