[发明专利]不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法

说明书

本发明公开了不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法，步骤包括：黑色素细胞的分离与纯化；引物设计及合成；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后总RNA提取及鉴定；反转录与目的片段扩增；PCR扩增产物纯化与回收；Gnαq cDNA序列测定；重组质粒的转化；质粒DNA提取；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq mRNA qRT‑PCR检测；不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后Gnαq蛋白水平检测；数据处理与统计分析。本发明通过分离纯化绵羊黑色素细胞，不同浓度α‑MSH处理，Real time PCR检测和WB检测结果显示，不同浓度α‑MSH处理黑色素细胞后，Gnαq基因的表达量呈降低趋势，α‑MSH对于Gnαq基因的表达不具有促进作用。因此，本发明验证了Gnαq基因对于黑色素的调控和α‑MSH不属于同一信号通路有关，作用机制得到了证实。

技术领域

本发明涉及到基因表达方法技术领域，特别涉及不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法。

背景技术

哺乳动物皮肤的色素沉着通过控制色素细胞数、颗粒量、类型以及色素向周围细胞转移的多种基因遗传调节。毛发颜色由毛囊中黑色素细胞产生，皮肤表皮中的黑色素细胞和真黑素，这些单独的黑色素细胞群体都源自神经嵴祖细胞迁移到不同的位置而产生。Gnαq和Gnα11是q类(Gα_q)的两个紧密相关的α亚基，在黑色素细胞与内皮素B受体偶联。内皮素信号通路是黑色素细胞存活/增殖在发育早期所必需的，但是一旦黑色素细胞在迁移期间进入表皮就不是必需的。小鼠中Gnαq和Gnα11的多态性突变导致耳朵，尾巴和足部的真皮变黑并且毛发微弱变暗。类似地，已经报道内皮素受体B配体，内皮素3在角质形成细胞中的转基因表达导致真皮过度色素沉着和毛发变黑。

α-MSH(MC1R)受体属于黑皮质素受体基团，还包括具有40-60％同源性的4种其它受体。这些受体结合促肾上腺皮质激素(ACTH)，所有这些受体(除MC2R)都可以结合α-MSH。其他黑色素细胞刺激肽(β和γ-MSH) 也可以结合MC1R和MC(3-5)R引起生物反应；MC2R仅是ACTH的特异性受体。黑皮质素受体与其多肽链通过7次质膜反应，成为与G-蛋白具有巨大相互作用的G-蛋白偶联受体(GPCR)家族成员。研究不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因的表达特性对于进一步了解黑色素调控机制尤为必要。取一定量黑色素细胞，加入不同浓度(0、10^-7、10^-8、10^-9mol/L)α-MSH，于48h收集黑色素细胞，提取总RNA用于Real time PCR检测、72h提取总蛋白用于WB检测。

就目前的研究成果，不能推测Gnαq基因对于黑色素的调控和α-MSH不属于同一信号通路有关，其具体的作用机制需进一步证实。

发明内容

发明的目的在于提供不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法，本发明验证了Gnαq基因对于黑色素的调控和α-MSH不属于同一信号通路有关，作用机制得到了证实，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后Gnαq基因表达特性的试验方法，实验材料包括绵羊黑色素细胞取自3月龄黑色绵羊皮肤，包括如下步骤：

S1：黑色素细胞的分离与纯化

绵羊黑色素细胞取自3月龄黑色绵羊皮肤，黑色素细胞的分离与纯化采取羊驼黑色素细胞分离纯化的方法进行；

S2：引物设计及合成

根据NCBI网站提供的参考序列，使用Primer 5.0软件设计2对特异性引物用于荧光定量PCR，交公司进行合成；

S3：不同浓度α-MSH处理黑色素细胞后总RNA提取及鉴定