[发明专利]一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用，属于基因工程及酶工程技术领域，本发明基于酶蛋白结构分析，设计及构建酶突变库，筛选获得偏好偏甘油酯底物的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的毕赤酵母工程菌，从而为该突变体的广泛应用奠定基础。本发明提供的海洋链霉菌脂肪酶突变体，与野生型的脂肪酶对比，其更高效催化合成富含n‑3脂肪酸的偏甘油酯，在最优的反应条件下，催化产物中偏甘油酯的含量为86.48％(其中49.01％PUFA‑DAG，37.47％PUFA‑MAG)，相对于野生型(PUFA‑DAG 3.8％)提高了约23倍。

技术领域

本发明涉及基因工程及酶工程技术领域，特别是涉及一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用。

背景技术

脂肪酶，即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅取决于它的蛋白质结构(Schmid等,1998)。脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。

酶学特性和酶的稳定性是影响其应用的关键因素之一；同时，很多酶学性质较好的蛋白在实际应用条件下，实际使用效果也不好。

寻找和克隆合适脂肪酶的途径有2个：一是筛选产新型酶的微生物；二是对酶进行适当的蛋白质工程改造。微生物菌种选育是工业生产和学术研究最常用和最简单的手段之一；但是，其缺点是工作量大，随机性强；因此往往很难筛选到理想菌株。而蛋白质工程是这些年新兴的、借用分子生物学和生物信息学的方法对蛋白进行定向突变和理性改造，而获得理想蛋白或酶的方法，其优点是工作量相对较小和概率大；缺点是多数突变体蛋白酶学性质没有改变或者变得更差。因此，获得更好效果的脂肪酶突变体一直是本领域的研究热点。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋链霉菌脂肪酶突变体及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明基于酶蛋白结构分析，设计及构建酶突变库，筛选获得偏好偏甘油酯底物的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的毕赤酵母工程菌，从而为该突变体的广泛应用奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种海洋链霉菌脂肪酶突变体，所述海洋链霉菌脂肪酶突变体是氨基酸序列为SEQ ID NO.1的脂肪酶的第40位氨基酸由Gly变为Phe。

上述海洋链霉菌脂肪酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

上述海洋链霉菌脂肪酶突变体的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO.3。

本发明还提供一种在宿主细胞内表达氨基酸序列为SEQ ID NO.2的海洋链霉菌脂肪酶突变体的重组质粒。

进一步地，所述重组质粒含有核酸序列为SEQ ID NO.3的核酸。

本发明还提供一种工程菌株，所述工程菌株含有在宿主细胞内表达氨基酸序列为SEQ ID NO.2的海洋链霉菌脂肪酶突变体的重组质粒或含有核酸序列为SEQ ID NO.3的重组质粒。

进一步地，所述工程菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris。

本发明还提供上述的海洋链霉菌突变体、上述的重组质粒、上述的工程菌株在制备富含n-3PUFA甘油二酯中的应用。

本发明公开了以下技术效果：

本发明基于酶蛋白结构分析，设计及构建酶突变库，筛选获得偏好偏甘油酯底物的脂肪酶突变体，并构建得到高效表达该突变体的毕赤酵母工程菌，从而为该突变体的广泛应用奠定基础。