[发明专利]一种RNA探针杂交捕获试剂及其制备方法

权利要求书

1.一种RNA探针杂交捕获试剂，其特征在于，所述RNA探针杂交捕获试剂中以Hybridbuffer为底物；采用Wash buffer1和Wash Buffer2进行漂洗；采用Binding Buffer重悬磁珠；

其中，所述Hybrid buffer包括10倍浓缩的SSPE，10倍浓缩的Dehard，10mM EDTA，5mMMgCl2，占总混合液浓度40％的盐酸葡聚糖，占总混合液浓度30％的DMF；

所述Wash buffer1包括1X SSC 12.5ml含0.1％SDS；

所述Wash Buffer2包括0.1X SSC含0.1％SDS；

所述Binding Buffer包括1M NaCl、10mM Tris-HCl和1mM EDTA。

2.一种RNA探针杂交捕获试剂的制备方法，制备如权利要求1所述的RNA探针杂交捕获试剂，其特征在于，包括以下步骤：

一、杂交操作；

1.1：取浓缩干燥好的DNA文库用的DEPC处理水，补足至6ul，吹打混匀离心后加入排管中，标记为B列；

1.2：将Hybrid buffer置于室温下融化后，取10μL Hybrid Buffer加入新的排管中，标记为A列；

1.3：混合探针，并将所述探针加入排管中，标记为C列；

1.4：将所述B列排管置于PCR仪中，运行Capture程序，热盖初始温度调整为105℃，逐渐降低，在所述热盖95℃的环境下处理5min，直至所述热盖温度保持在65℃；

1.5：当所述热盖转入65摄氏度时，将离心过的A列排管和C列排管置于B列排管的两侧，盖紧所述热盖，预热处理5min；

1.6：预热结束后，吸取所述A列排管中试剂13μL加入至所述C列排管中，将所述B列排管中试剂全部加入至所述C列排管中，盖上新管盖；

1.7：盖上所述热盖，对所述C列排管内试剂进行杂交，杂交时间大于等于2h；

二、采用Binding Buffer重悬磁珠，将重悬的所述磁珠装入排管置于PCR仪内预热；

三、将所述磁珠置于所述C列排管中与所述探针混合；

四、将所述C列排管内混合液采用Wash buffer1进行洗涤；

五、将所述C列排管内混合液采用Wash buffer 2进行洗涤；

六、采用百分之80的乙醇对所述C列排管内混合液进行洗涤；

七、采用双蒸馏水对所述C列排管内混合液重悬磁珠，取重悬液进行PCR扩增，得到所述探针杂交捕获试剂。

3.根据权利要求2所述的RNA探针杂交捕获试剂的制备方法，其特征在于，在步骤1.3中，所述混合探针包括2μL的V7全外显子探针和5μL的一倍浓缩的RNase Block。

4.根据权利要求2所述的RNA探针杂交捕获试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二包括以下步骤：

2.1：以每个杂交反应捕获50μL的量取Dynabeads，加入至2ml EP管中，将所述EP管放入磁力架，待磁珠全部吸附至侧壁，弃尽管中液体；

2.2：取所述磁珠两倍体积的Binding Buffer重悬所述磁珠，再将所述EP管放入磁力架，待所述磁珠全部吸附至侧壁，弃尽管中液体；

2.3：重复上述步骤2.2，共漂洗3次；

2.4：取Binding buffer，按每个杂交反应捕获200μL的量重悬所述磁珠，将重悬的所述磁珠置于新的排管中；

2.5：将装有所述磁珠的排管置于PCR仪内，在65℃的环境下预热5min，热盖温度为105℃。

5.根据权利要求2所述的RNA探针杂交捕获试剂的制备方法，其特征在于，所述步骤三包括：

3.1：将所述磁珠加入到所述C列排管中，盖上新管盖；

3.2：将加入所述磁珠的所述C列排管放入翻转混匀仪，以30转/min翻转混匀30min；

3.3：翻转混匀结束后，将所述C列排管放入磁力架上，室温下静置1min，待所述磁珠吸附至侧壁，弃尽上清。