[发明专利]获得cfDNA标准品的引物组、PCR扩增阳性标准品及其制备方法、试剂盒及应用

权利要求书

1.一种用于扩增获得cfDNA标准品的引物组，其特征在于，包括：第一上游引物和第一下游引物，所述第一上游引物包括从5’端到3’端顺次连接的第一外源序列和第一锚定序列，所述第一下游引物包括从5’端到3’端顺次连接的第二外源序列和第二锚定序列；所述第一外源序列和所述第二外源序列之间不互补配对，且与人类的任一染色体上的任意核苷酸序列不互补配对；所述第一锚定序列和所述第二锚定序列为人类的同一染色体上的保守核苷酸序列，且所述第一锚定序列和所述第二锚定序列的组合能够用于扩增第一靶序列；所述第一靶序列为由从5’端到3’端顺次连接的人类染色体上的所述第一锚定序列及其互补序列，所述第一锚定序列和所述第二锚定序列之间的双链核苷酸序列，和所述第二锚定序列及其互补序列组成的具有固定长度的双链核苷酸分子。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一靶序列是人类染色体中的保守核苷酸序列；

优选的，所述第一靶序列在人类的染色体上具有多个拷贝。

3.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一靶序列位于L1PA2、Alu、hTERT、human APP、β-actin、EIF2C1或RPPH1基因上；

优选的，所述第一靶序列的长度在50bp～150bp之间，更优选在60bp～120bp之间。

4.一种PCR扩增阳性标准品，其特征在于，所述PCR扩增阳性标准品为单链核苷酸分子或双链核苷酸分子，

当PCR扩增阳性标准品为单链核苷酸分子时，包括：从5’到3’端依次为第一外源序列、第一中间序列和第二外源序列的互补序列；或从5’到3’端依次为第二外源序列、第二中间序列和第一外源序列的互补序列；

当PCR扩增阳性标准品为双链核苷酸分子时，其中的一条链包括：从5’到3’端依次为第一外源序列、第一中间序列和第二外源序列的互补序列；或从5’到3’端依次为第二外源序列、第二中间序列和第一外源序列的互补序列；

所述第一中间序列和第二中间序列互补配对，所述第一中间序列和第二中间序列互补配对后的双链核苷酸分子为第一靶序列；所述第一靶序列为由从5’端到3’端顺次连接的人类染色体上的第一锚定序列及其互补序列，所述第一锚定序列和第二锚定序列之间的双链核苷酸序列，和所述第二锚定序列及其互补序列组成的具有固定长度的双链核苷酸分子；所述第一外源序列和所述第二外源序列之间不互补配对，且与人类的任一染色体上的任意核苷酸序列不互补配对；所述第一锚定序列和所述第二锚定序列为人类的同一染色体上的保守核苷酸序列，且所述第一锚定序列和所述第二锚定序列的组合能够用于扩增所述第一靶序列。

5.一种PCR扩增阳性标准品的制备方法，其特征在于，包括采用如权利要求1至3中任一项所述的引物组，对标准品扩增模板进行PCR扩增，获得PCR扩增阳性标准品；其中，所述标准品扩增模板为血浆、从血浆中提取获得的cfDNA、或人工制备的gDNA来源的模拟cfDNA片段分布的DNA片段；

优选的，对所述标准品扩增模板进行PCR扩增后还包括对扩增产物进行纯化的步骤。

6.一种用于对血浆样本的cfDNA检测的血浆阳性标准品，其特征在于，包括如权利要求4所述的PCR扩增阳性标准品和血浆；

优选的，所述血浆阳性标准品中含所述PCR扩增阳性标准品的浓度在1ng/mL至1000ng/mL之间；

优选的，所述血浆为人类血浆。