[发明专利]用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分铜绿微囊藻与其它微囊藻属，以及产毒和非产毒的铜绿微囊藻属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒铜绿微囊藻的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒铜绿微囊藻进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

“水华”是淡水中的一种自然生态现象，涉及到的藻类有蓝藻(即蓝细菌)、绿藻、硅藻等。自然形成的水华现象会很快消失，并不会带来环境影响。而人为的往水体中排放氮盐(主要是铵盐、硝酸盐和亚硝酸盐)和磷盐(主要是正磷酸盐和各种形态的磷酸盐)，使得淡水富营养化。当水中磷化物过高，会有利于蓝绿藻的生长。而当这些营养物超出环境容量和自净能力，会令“水华”频繁出现，面积逐年扩散，持续时间逐年延长。中国的太湖、滇池、巢湖、洪泽湖都有水华现象，这可能与含磷的清洁剂不断被排放到水体有关。“水华”造成的最大危害是：饮用水源受到威胁，藻类毒素通过食物链影响人类健康。例如蓝藻的次生代谢产物能损害肝脏，有致癌可能性。

微囊藻属(Microcystis)是蓝藻中一个很重要的类群。随着世界范围内水体富营养化的发展，微囊藻在世界各地不仅产生严重的“水华”，而且形成藻毒素及异味物质，直接影响水生态环境的安全，威胁人类的健康；因此关于微囊藻的研究备受关注，成为世界水环境问题的一个焦点。铜绿微囊藻是微囊藻属中的重要成员之一，它是一种出现在淡水中的蓝菌，携带微囊藻毒素的藻种会产生有害藻华，对水环境和人畜饮水安全造成严重危害，具有一定的生态学与经济重要性。铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)是在富营养化淡水中最主要的产毒素蓝菌藻华的来源，在自然水体中呈常态流行。温暖季节水温在28～32℃时，铜绿微囊藻繁殖快，生长旺盛，使水体呈灰绿色，形成水华，肉眼可见，其浮膜似铜绿色油漆，有臭味。

藻毒素对人类或动物造成严重的伤害，轻则导致中毒，重则诱发严重疾病而导致死亡。国内外已经报道了大量关于藻毒素中毒事件，引起科研工作者的广泛关注。因此，对蓝藻毒素进行定性定量检测在藻毒素危害的预防预警上尤为重要。数据库中海量的生物信息，为我们建立以基因为检测对象的快速、高效的检测方法提供了可能。在自然水体中，同一藻种的产毒藻株和非产毒藻株二者往往同时存在，且其种群动态变化规律存在时空差异，产毒藻群落组成及其动态变化直接影响到水体中藻毒素浓度。使用常规显微镜观察无法有效区分和鉴别产毒与非产毒两类藻细胞，而各种藻毒素合成酶基因的分离和功能研究，使我们可以利用PCR(polymerase chain reaction)技术、荧光定量PCR技术等分子生物学技术检测藻毒素合成的关键基因，进而检测铜绿微囊藻产毒情况。Mcy(microcystinsynthesis gene)基因是微囊藻毒素的合成酶基因，也是目前研究较多的藻类毒素合成基因。从基因的角度来定性检测水体中是否含有产毒能力的蓝藻存在，以及定量检测产毒蓝藻的含量，在藻毒素释放前，对其危害起到预警作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒铜绿微囊藻的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、检测铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1以及产毒特异性基因gene2；

S4、读取扩增Ct值；当所述铜绿微囊藻属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阳性；当所述铜绿微囊藻属特异性基因rpoB、gene1的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene2的Ct值大于35时，产毒铜绿微囊藻的检测结果为阴性。