[发明专利]FFPE样本DNA文库及其构建方法在审
| 申请号： | 201910848843.X | 申请日： | 2019-09-09 |
| 公开（公告）号： | CN110511978A | 公开（公告）日： | 2019-11-29 |
| 发明（设计）人： | 刘运超;李富威;方楠;伍启熹;王建伟;刘倩;唐宇 | 申请（专利权）人： | 北京优迅医学检验实验室有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6806 | 分类号： | C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 11240 北京康信知识产权代理有限责任公司 | 代理人： | 路秀丽<国际申请>=<国际公布>=<进入 |
| 地址： | 100195 北京市海淀区*** | 国省代码： | 北京;11 |
| 权利要求书： | 查看更多 | 说明书： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 样本DNA 接头连接 连接产物 随机引物 单链DNA 双链DNA 第一端 富集 构建 建库 文库 变性处理 操作流程 磁珠纯化 接头序列 随机扩增 随机序列 有效解决 端接头 兼容性 降解 成功率 样本 引入 延伸 | ||
1.一种FFPE样本DNA文库的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
对FFPE样本DNA进行变性处理，得到单链DNA；
采用随机引物对所述单链DNA进行随机扩增延伸，得到双链DNA，所述随机引物按5’端到3’端的方向依次包含第一端接头序列及随机序列；
对所述双链DNA进行第二端接头的连接，得到连接产物；
对所述连接产物进行PCR富集，得到所述FFPE样本DNA文库。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在对所述DNA进行变性处理前，所述构建方法还包括对所述DNA进行片段化处理，得到片段化的DNA。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头的3’端带有磷酸化修饰或反向dT修饰。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在对所述双链DNA进行第二端接头的连接步骤之前，所述构建方法还包括形成所述第二端接头的步骤；
优选形成所述第二端接头的步骤包括：
将接头1和接头2等质量混合，得到混合接头；
对所述混合接头进行退火，得到所述第二端接头。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述随机引物中的所述随机序列的长度为1～10bp，优选为2～6bp；
更优选地，所述随机引物为SEQ ID NO:1：5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTNNNN-3’，其中NNNN为所述随机序列；
进一步优选地，所述随机引物的退火温度为40～50℃，最优选为45～48℃；延伸温度为60～68℃，最优选为63～66℃。
6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头中，
所述接头1的序列为SEQ ID NO:2：5'-GACGCTCTTCCGATCT[Phos]-3’；
所述接头2的序列为SEQ ID NO:3：
5'-[Phos]GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT[Phos]-3’。
7.根据权利要求6述的构建方法，其特征在于，所述第二端接头的连接温度为16～20℃。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用P5引物和P7引物对所述连接产物进行PCR富集，得到所述FFPE样本DNA文库；
优选地，所述P5引物的序列为SEQ ID NO:4：
5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，
所述P7引物的序列为SEQ ID NO:5：
5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT
9.根据权利要求1或8所述的构建方法，其特征在于，在对所述连接产物进行PCR富集之后，以及得到所述FFPE样本DNA文库之前，所述构建方法还包括对所述PCR富集后的产物进行纯化的步骤，优选采用磁珠进行所述纯化；更优选地，采用等体积的磁珠进行所述纯化。
10.一种FFPE样本DNA文库，其特征在于，所述FFPE样本DNA文库采用权利要求1至9中任一项所述的构建方法构建而成。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。该专利全部权利属于北京优迅医学检验实验室有限公司，未经北京优迅医学检验实验室有限公司许可，擅自商用是侵权行为。如果您想购买此专利、获得商业授权和技术合作，请联系【客服】
本文链接：http://www.vipzhuanli.com/pat/books/201910848843.X/1.html，转载请声明来源钻瓜专利网。
