[发明专利]一种能够识别EpCAM蛋白的核酸适体及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种能够识别EpCAM蛋白的核酸适体的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：筛选上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸适体文库；

步骤2：基于模式序列搜索，对步骤1筛选得到的上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的核酸适体文库进行过滤；基于k-mer的频率分布和扩增倍数分布，k-mer为k长的连续碱基片段，对核酸文库测序数据进行筛选，得到具有富集/富集趋势的k-mer集合；然后设计打分公式，通过权衡频率和扩增信息，对筛选得到的具有富集/富集趋势的k-mer集合中的k-mer打分，得到Score_k-mer，基于Score_k-mer，设计过滤分值FilterScore_aptamer公式，根据用户定义的域值，过滤掉不具有模式序列的序列；所述打分公式如下：

k-mer(i)为第i个k-mer，i＝1，2，3....n；

所述过滤分值FilterScore_aptamer公式如下：

Filter Score_aptamer(i)＝max(score_k-mer(j)|k-mer(j)∈S_aptamer，S_aptamer由aptamer包含的所有k-mer组成)

aptamer(i)为第i个aptamer，i＝1，2，3....n；

利用k-mer的频率分布，筛选具有富集/富集趋势的k-mer集合，即在文库中出现的高频k-mer，定义为set1，此处高频k-mer的选择为在各轮文库中频率高于预先定义的对照文库频率分布中95％分位线的k-mer；绘制k-mer扩增倍数分布，筛选与set1同样大小的k-mer集合set2，其由具有最大扩增倍数的k-mer组成；

步骤3：利用无监督学习，对步骤2过滤后的核酸文库测序数据进行文库序列家族高效分类；通过对步骤2过滤后得到的所有核酸适体序列进行两两比对，利用BLASTshort进行所有核酸适体序列比对打分，基于比对分值构建核酸相关性图谱，其中，权重Weight_edge(ab)为归一化后的比对得分，利用马尔可夫聚类算法(MCL)进行家族分类；

所述权重的计算公式如下：

其中，bitscore为BLAST比对算法输出的比对得分；a,b代表任意两个顶点；

步骤4：基于步骤3的文库序列家族分类结果，进行核酸适体二级子结构/模式序列含量Kscore评估；基于步骤3的家族分类结果，选择每个家族中最高频核酸作为代表序列，根据步骤2所得的k-mer得分，计算该代表序列对应的Kscore，即为核酸家族Kscore；所述核酸家族Kscore的计算公式如下：

Kscore_aptamer(i)＝∑score_k-mer(j)，k-mer(j)∈S_aptamer(i)

其中，Kscore_aptamer为每个核酸家族代表序列的二级子结构/模式序列总体富集程度，随后即将代表序列的Kscore_aptamer作为核酸家族Kscore；

步骤5：基于步骤3的文库序列家族分类结果，根据家族大小，进行核酸适体家族富集程度Fscore评估；核酸家族富集程度Fscore的计算公式如下：

其中，familly(i)代表第i个家族，i＝1,2,3....n；Fsize为家族大小，mean为平均家族大小；

步骤6：基于二级结构最小自由能和G四聚体结构预测，对步骤3的文库序列家族分类结果进行核酸适体二级结构稳定性Sscore评估；利用mfold或者RNAfold进行核酸适体二级结构最小自由能(dG)推导，利用QGRS进行核酸适体是否为G四聚体的可能性(GS)计算，权衡最小自由能和GS得分得到Sscore；

所述Sscore的计算公式如下：

其中，familly(i)代表第i个家族，i＝1,2,3....n；r_aptamer代表每个核酸适体家族的最高频序列；

步骤7：利用多维度分析框架，从二级子结构/模式序列含量Kscore、核酸适体家族富集程度Fscore、二级结构稳定性Sscore三个方面对功能核酸进行全面评估和权衡，识别得到能够识别EpCAM蛋白的核酸适体；选取Kscore、Fscore、Sscore中较大的两个分值，进行加和平均得到最终的MDA-score用于评估功能核酸的性能，MDA-score分值越高，认为其靶标结合可能性越大；所述MDA-score的计算公式如下：

其中，min_score代表三个分值中的最小值。