[发明专利]ICOS

权利要求书

1.一种ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞的用途，其特征在于：用于制备预防重症肺炎的药物。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

其中，所述预防肺炎的药物包括ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

其中，所述预防肺炎的药物制剂为注射剂。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：

其中，所述ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞的分离方法为：

步骤一、分离小鼠脾脏单个核细胞，获得小鼠脾脏单个核细胞悬液；

步骤二、在所述小鼠脾脏单个核细胞悬液中，磁珠分选CD4T细胞，获得CD4T细胞悬液；

步骤三、在所述CD4T细胞悬液中，流式分选ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：

其中，所述步骤一的具体过程为：

脱颈椎处死小鼠，浸泡于75％酒精内消毒，然后取出固定于小鼠解剖板上；

从小鼠会阴部剪口并划向头部，剥开外皮固定，在腹部包膜处剪口，取出脾脏，加入预冷的PBS缓冲液，用毛玻片研磨组织碎片，经200目尼龙膜过滤制成单细胞悬液；

在4℃、1650rpm条件下，离心5分钟，弃上清；

将脾细胞轻轻弹起，加入2ml红细胞裂解液，吹打混匀，室温静置2分钟；

补加10ml PBS缓冲液终止反应，在1650rpm、4℃条件下，离心5分钟，弃上清；

PBS缓冲液再次重悬洗涤细胞，离心，弃上清；

4mL细胞完全培养液重悬细胞，取10μl细胞悬液加入到90μl台盼蓝内，计数并调节细胞浓度至工作浓度1×10⁶/mL。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：

其中，所述步骤二的具体过程为：

取脾脏细胞悬液，300g，4℃离心细胞，除尽上清；

按照每10⁷个细胞加入90μl MACS缓冲液的比例，加入缓冲液后重悬细胞；

按照每10⁷个细胞加入10μlCD4(L3T4)微珠的比例，将微珠加入细胞悬液；

轻轻吹打均匀，4℃孵育15分钟；

按每10⁷个细胞加入2ml MACS缓冲液的比例，加入缓冲液洗涤细胞，然后取300g，4℃离心细胞，除尽上清；

加入500μl缓冲液重悬细胞，并转移至MACS缓冲液平衡过并已安置于磁铁架上的LS柱内；

用MACS缓冲液洗涤LS柱3次，每次5ml；

将LS柱从磁铁架上取下，置于15ml离心管上，在LS柱内加入5ml MACS缓冲液，用力用活塞快速将液体推出LS柱，收集流出液，即为纯化的CD4T细胞悬液；

取300g，4℃离心细胞，除尽上清，PBS重悬细胞至浓度为2×10⁷个/mL，置于冰上备用。

7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：

其中，所述步骤三的具体过程为：将分离好的CD4T细胞用抗-CD25-APC、抗-CD4-FITC、抗-ICOS-PerCP-Cy5.5及抗-CXCR3-PE单克隆抗体进行染色标记，利用BD-ARIA分选收集ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞。

8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：

其中，所述ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞的体外扩增培养过程为：

将分离好的所述ICOS⁺CXCR3⁺调节性T细胞种于96孔U型板中，每孔5×10⁴个细胞，在37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下用10％小牛血清的RPMI1640培养基200μl培养该细胞；

培养体系内还含有2mmol/L谷氨酰胺，25mmol/L HEPES，50U/mL青霉素，50μg/mL链霉素，50μmol/L 2-巯基乙醇，100nmol/L的雷帕霉素，400U/mL白介素-2，以及小鼠T细胞扩增磁珠；

第一周磁珠数目是细胞数的4倍，之后与细胞的比例为1:1；

显微镜下观察细胞生长情况，约3天换液1次，1:3传代，用含有以上成分的新鲜RPMI1640补充培养基到200μl；

培养2～3周后的收集细胞。