[发明专利]一种肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤预警检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤预警检测试剂盒，包括线粒体DNA质粒标准品、小鼠线粒体扩增引物及探针、人线粒体扩增引物及探针；线粒体DNA质粒标准品为含有小鼠线粒体DNA片段Mouse‑MT的重组载体；小鼠线粒体扩增引物上游序列如SEQ ID No.1所示；下游序列如SEQ ID No.2所示；小鼠线粒体探针序列如SEQ ID No.3所示；人线粒体扩增引物上游序列如SEQ ID No.4所示；下游序列如SEQ ID No.5所示；人线粒体探针序列如SEQ ID No.6所示。本发明所提供的试剂盒检测肝移植术后缺血再灌注损伤灵敏度高，可以早期预警，检测窗口期较现有技术可提前2～4小时，为患者缺血再灌注损伤治疗争取了宝贵时间。

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说是一种肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤预警检测试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤，是引起肝移植排斥反应及肝移植失败的重要原因之一。

肝移植术后缺血再灌注后肝脏小叶结构开始破坏，出现出血及炎性反应、细胞皱缩核分裂甚至坏死和凋亡。缺血再灌注损伤分为两个阶段—损伤初期：缺血再灌注损伤2小时之内；损伤后期：缺血再灌注损伤后6小时。随着缺血再灌注时间从1小时至12小时，肝脏损伤速度快且严重程度显著增加。因此，肝移植术后早期预警及快速检测肝移植缺血再灌注损伤，积极进行改善治疗是防止移植失败和挽救患者生命的重要手段。

目前在临床上，移植后动态监测肝脏功能改变成为诊断肝移植缺血再灌注损伤的主要临床指标。然而，当肝脏功能改变时说明缺血再灌注损伤已经发生且肝脏功能明显受损了。

如何能够无创且更敏感的监控及预警肝移植术后缺血再灌注损伤一直是临床的热切关注点之一。

由于肝脏是重要的代谢器官，功能非常活跃，因此肝细胞中含有大量的线粒体，每个线粒体又含有多拷贝线粒体DNA，而且线粒体DNA只有16kb，因此线粒体DNA的拷贝数是基因组DNA拷贝数的数千到上万倍。通过检测游离供体线粒体DNA来分析供体肝组织的死亡将具有非常高的灵敏性。发明人在最近的研究中，利用肝移植的供受体肝脏及受体PBMC和移植后胆汁中的线粒体DNA 的D-loop一代测序序列，发现每一对供体和受体之间至少存在两个以上SNP 差异，而胆汁中来源的线粒体DNA的D-loop一代测序结果与供体肝脏的完全一致，因此，胆汁线粒体主要来源于供体肝脏，这为发明人利用胆汁中线粒体 DNA水平变化来特意检测供体细胞是否死亡提供了支持。为此，发明人研究了胆汁线粒体DNA绝对定量技术。在进一步的研究工作中，利用定量的小鼠线粒体DNA做为内对照，对胆汁中的供受体D-loop DNA进行绝对定量，并与肝功及胆红素等反应肝再灌注损伤的临床数据对比分析，结果显示，利用胆汁 D-loop的定量分析与常规临床方法相比，不仅通过动态分析发现胆汁线粒体 DNA Copies与血浆转氨酶水平成线性相关性，而且对于重度缺血再灌注损伤的患者的检测敏感性显著增高，检测窗口也较显著提前2小时，因此，肝移植后胆汁绝对线粒体定量水平是一个重要的肝移植缺血再灌注损伤标志物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提出一种灵敏度高无创的肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤预警检测试剂盒，该试剂盒可以将肝移植术后缺血再灌注预警时间提前2～4小时。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种肝移植术后肝脏缺血再灌注损伤预警检测试剂盒，包括线粒体DNA质粒标准品、小鼠线粒体扩增引物及探针、人线粒体扩增引物及探针；

所述线粒体DNA质粒标准品为含有小鼠线粒体DNA片段Mouse-MT的重组载体；

所述小鼠线粒体扩增引物上游序列如SEQ ID No.1所示；下游序列如SEQ ID No.2所示；所述小鼠线粒体探针序列如SEQ ID No.3所示；