[发明专利]检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，由外引物F3和外引物B3、内引物FIP和内引物BIP组成；基于LAMP引物组的试剂盒，包括检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组、免提取核酸扩增反应液和LAMP法鉴定反应液；基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的方法，利用外引物F3和B3对样品粗提液进行免提取扩增得到模板DNA，再利用内引物FIP和BIP进行恒温扩增，再加入LAMP法鉴定反应液观察结果；本发明结合免提取核酸扩增技术与环介导等温扩增技术，在无需PCR仪、提取DNA的前提下，利用待测动物组织或器官研磨或其唾液或尿液等物质进行免提取操作获得模板，再恒温水浴扩增后目视判断，简便快捷。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，本发明还涉及上述非洲猪瘟病毒的试剂盒，以及上述非洲猪瘟病毒的检测方法。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African Swine fevervirus，ASFV)感染家猪和各种野猪(非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175-215纳米，呈20面体对称，有囊膜。基因组为双股线状DNA，大小为170-190kb。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。本病毒能从被感染猪之血液、组织液、内脏，及其他排泄物中证实出来，低温暗室内存在血液中之病毒可生存六年，室温中可活数周，可见其危害严重性。加热被病毒感染的血液55℃下30min或60℃下10min，病毒将被破坏，许多脂溶剂和消毒剂可以将其破坏。

疫病防控一直是猪场管理的重要环节，一旦出现缺位，将会导致严重后果，特别是在非洲猪瘟疫情高压下，疫病防控的好坏直接决定猪场的存亡。而疫病防控工作的到位、生物安全是否存在漏洞、发病猪场恢复的生产依据均来自于对非洲猪瘟病毒的检测。各级畜牧兽医部门要将非洲猪瘟疫情排查作为当前防控工作的重要内容，鼓励规模猪场、种猪场配置检测仪器设备，规范使用经我部批准或经中国动物疫病预防控制中心比对符合要求的检测方法，自行开展非洲猪瘟检测，提高排查工作的针对性和有效性。

免提取核酸扩增技术，是在无需提取待测动物DNA的前提下，直接利用其组织或器官研磨呈匀浆状或其唾液或尿液等物质，加入免提取核酸扩增反应液直接进行核酸扩增，但其扩增需要PCR仪来完成，涉及到PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2～3万，贵的20多万，且PCR 方法操作起来较复杂，对仪器和人员要求比较高，不适合基层或现场快速诊断，因此在国内的推广速度并不是很快。

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是 2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件反应一定时间，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，现己广泛应用于各个领域，如食品、环境、临床、工农业及畜牧业，但需要提取待测动物DNA作为模板，加大的材料准备的难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测非洲猪瘟病毒的LAMP引物组，通过设计该引物组能够建立一种面提取LAMP可视化检测技术，实现对非洲猪瘟病毒的检测。

本发明的另一目的是提供一种基于LAMP引物组检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，能够快速、简便的进行扩增，用于病毒检测。