[发明专利]一种抗HER3单链抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种抗HER3单链抗体的制备方法，包括以下步骤，设计抗HER3单链抗体基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，并合成该基因，并克隆至质粒pGAPZαA中，获得重组质粒；将重组质粒转化至毕赤酵母，并筛选出高表达菌株；将筛选出的高表达菌株在液体YPD培养基中进行发酵，获得发酵液并浓缩发酵液；进行疏水层析纯化；进行镍柱亲和层析纯化；进行G25分子筛置换缓冲液。本发明成功使得抗HER3单链抗体在毕赤酵母中高水平表达，实现利用重组酵母菌株进行发酵获取的发酵上清液中高效纯化抗HER3单链抗体，纯化产物纯度高，并且产率高，其抗HER3‑scFv得到正确表达，并可特异识别HER3，有利于抗HER3单链抗体的应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种抗HER3单链抗体的制备方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3/ERBB3)是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)家族中的第三个成员，与其他成员的结构类似，HER3也由胞外配体结合区、跨膜区和胞内酪氨酸激酶区三部分组成。

由于胞内酪氨酸激酶活性缺失，长期以来HER3作为治疗靶点并未受到重视。近年随着研究的不断深入，HER3与肿瘤的发生发展、预后的关系不断被揭示。HER3通常与EGFR家族中的其他成员，如EGFR、HER2等共表达于肿瘤细胞的表面，并与之形成异源二聚体参与肿瘤信号，特别是PI3K/AKT磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PK B,又称AKT)通路、Src激酶信号的传导，促进肿瘤细胞的存活、增殖和迁移。

HER3高表达于前列腺癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤的细胞表面，这种表达量的高低与肿瘤的进展、预后密切相关，若表达量高则进展快、预后差。研究还发现，HER3信号通路的激活是赫赛汀、吉非替尼等多种靶向药物产生耐药的一个重要原因。阻断HER3信号通路，则可使耐药细胞对药物重新敏感、抑制HER3高表达肿瘤的生长。

因此，HER3已成为新药研究中的热门靶点。目前已有U3-1287、MM-121和LJM716等抗HER3的单克隆抗体药物处于临床研究阶段。其中LJM716单克隆抗体是筛选自全合成人组合抗体文库(fully synthetic human combinatorial antibody libraries，HuCAL)的高亲和力抗体，其作用于HER3胞外区的Ⅱ和Ⅳ结构域，使HER3处于无活性构象中，从而阻断受体的活化和信号的转导。LJ M716抗体在配体依赖和非依赖的HER3激活通路、HER2过表达信号通路以及其他配体激活通路中均有着显著的抑制作用，具有良好的发展前景。

但由于单克隆抗体分子量较大，免疫原性强，在肿瘤组织的渗透性较差，一定程度上影响到单抗的效用功能。另外，单抗的生产成本高昂，给病人带来了沉重的经济负担。因此，研究开发具有相同抗原结合特性的小分子抗体就具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抗HER3单链抗体的制备方法。

本发明的第一个目的是提供一种抗HER3单链抗体。

本发明的第二个目的是提供一种抗HER3单链抗体的编码基因。

本发明的第三个目的是提供所述抗HER3单链抗体的高效制备方法。

本发明的第四个目的是提供所述的筛选出高表达菌株的方法筛选出的高表达菌株。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：