[发明专利]一种抗过敏肽及其制备方法

权利要求书

1.一种抗过敏肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、大西洋鲑内脏酶解产物的制备：将含有12％底物的蒸馏水（w/v）与胃蛋白酶混合，然后使用1M HCl将pH调节至2.0，37℃保温8 h释放抗过敏肽，100℃加热15 min灭活胃蛋白酶，冷却后，使用0.45μm滤膜进行抽滤，去除未水解的蛋白质，将酶解液清液冻干并保存于-20℃直至使用；

S2、抗过敏活性测定：取4个EP管，分别标上A、B、C、D，之后步骤如下：A、B管加入100L缓冲液，C、D管加入100μL样品液，A、C管加入50μL透明质酸酶液，B、D管加入50μL缓冲液，37℃孵育20min后，加入20μL 2.5mol/L CaCl₂ 溶液，37℃孵育20min，然后在各管加入50μL透明质酸，100μL缓冲液，250μL去离子水，37℃孵育40min，室温放置10min，之后在每管加入110μL碱性硼酸盐溶液，沸水加热5min终止反应，冰水浴20min，最后在每管加入1.5ml p-二甲氨基苯甲醛，37℃孵育20min，于585nm处测定吸光值，并计算出抑制率；

S3、抗过敏肽初步分离纯化研究：以透明质酸酶抑制率为抗过敏指标，探究不同分子量的肽段的抗过敏活性，采用MW10.0kDa和MW3.0kDa的超滤膜将目标水解液分成了三个组分I，II，III，分别为MW10Kda，3KdaMW10Kda，MW3Kda，各组分显示出不同的抗过敏活性，其中III MW3.0 kDa的组分过敏活性最强，对透明质酸酶活性的抑制率高达66.24%，选用Ⅲ进行进一步分离纯化；

S4、凝胶层析分离纯化抗过敏肽：采用Sephadex G-15 葡聚糖凝胶层析对组分Ⅲ进行进一步的分离纯化，采用 Sephadex G-15 作为凝胶填料，将其进行预处理后装于规格为16×900mm 的玻璃层析柱中，在1 ml/min的流速下用超纯水进行洗脱，于214nm处检测并收集各洗脱峰对应的洗脱溶液，冷冻干燥后测定各组分的抗过敏活性，选择抗过敏活性最强的组分进行下一步的纯化；

S5、反相高效液相色谱分离纯化抗过敏肽：将10 mg/ml的样品用0.22μm注射器过滤，样品自动注入Pursuit 10 C₁₈，250×21.2mm的安捷伦反相高效液相色谱柱，进一步纯化，以1.0 mL/min的流速进行分离，得到 C1-C6六个组分，线性梯度为0-50%洗脱液B，分离时间为25 min，在215 nm处检测各组分的洗脱峰，收集透明质酸酶抑制活性最强的峰并冻干；

S6、LC-MS/MS鉴定抗过敏肽：利用 LC-MS/MS对S5中抗过敏性最高的组分进行鉴定，得到一序列为TPEVHIAVDKF，MH+为1255.67Da经合成后验证具有抗过敏作用的肽段，通过对该鉴定出的序列TPEVHIAVDKF进行化学合成，然后采用抗DNP-IgE/DNP-BSA体系构建RBL细胞致敏-激发模型，测定合成肽对RBL细胞脱颗粒释放β-氨基己糖苷酶（β-HEX）的抑制效果，通过测定β-HEX在培养基中的释放，评价纯化肽的抗过敏作用。

2.根据权利要求1所述的一种抗过敏肽的制备方法，其特征在于：S1中，胃蛋白酶与底物的混合比率为1：100（w/w）。

3.根据权利要求1所述的一种抗过敏肽的制备方法，其特征在于：S2中所述的缓冲液配备方式为：取16.406g无水醋酸钠和8.766g氯化钠溶于800ml蒸馏水中，用冰乙酸调PH值为4.6，并定容1000ml，制得含0.15M氯化钠的0.2M醋酸钠缓冲液，其中离子强度为0.15M。

4.根据权利要求1所述的一种抗过敏肽的制备方法，其特征在于：S2中所述的碱性硼酸盐溶液包括17.3g H₃BO₃和7.8g KOH，且定容至100mL，所述碱性硼酸盐溶液用前每10mL加入1mL 0.8g/mL K₂CO₃。

5.根据权利要求1所述的一种抗过敏肽的制备方法，其特征在于：S2中所述的P-二甲氨基苯甲醛包括20g p-二甲氨基苯甲醛，25mL浓盐酸和75mL冰乙酸，且P-二甲氨基苯甲醛用前立即用4倍体积的冰乙酸进行稀释。