[发明专利]一种酶法制备4-羟基苯乙醛的方法

说明书

本发明公开了一种酶法生产4‑羟基苯乙醛的方法，属于生物技术领域，所述方法为克隆高活性的伯胺氧化酶基因，连接表达载体并转化大肠杆菌感受态细胞，构建伯胺氧化酶工程菌，进而利用发酵的伯胺氧化酶催化酪胺氧化生产4‑羟基苯乙醛。本发明采用酶法生产4‑羟基苯乙醛，反应条件温和、环境友好、生物酶催化反应专一性强，采用两相催化体系降低产物对酶的抑制效应，反应产率高，且催化与分离耦合，有利于产物提取，同时本发明所述的生产方法所使用的原料廉价易得，且生产工艺简单易行、生产成本较低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地涉及一种酶法生产4-羟基苯乙醛的方法。

背景技术

芳香醛是一类非常重要的精细化学品，因其分子中含有活泼的醛基，可以延伸合成多种产品，广泛应用于医药、食品及农业领域。4-羟基苯乙醛作为一种重要的芳香醛，可作为合成苄基异喹啉生物碱、酪醇及4-羟基苯乙酸等物质的重要前体，具有广泛的应用价值，市场前景非常广阔。

伯胺氧化酶(PrAOs,EC 1.4.3.21)是一种重要的含铜胺氧化酶，在生物胺代谢中发挥重要作用，可以转化伯胺生成相应的醛，并产生等摩尔的铵和过氧化氢。伯胺氧化酶广泛存在于大肠杆菌，节杆菌，产气肠杆菌，多形汉逊酵母等原核和真核微生物中，多数具有较宽的底物谱，但不同种属的微生物仍有不同的底物谱。大肠杆菌伯胺氧化酶对芳香胺具有较高的底物偏好，利用大肠杆菌伯胺氧化酶氧化酪胺生产4-羟基苯乙醛是非常有前景的方法，具有环境友好、转化效率高等优点。

4-羟基苯乙醛可以通过化学合成法进行制备，以脱氧肾上腺素为原料经热酸处理得到，反应条件剧烈，反应时间长、产物得率低，环境不友好，成本高，难以放大生产。新的生物转化法生产工艺被认为是最有前景的替代方法。然而生物酶在水相中的催化反应往往受到底物溶解度差和产物对生物酶的毒性的限制，难以规模化生产。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种酶法生产4-羟基苯乙醛的方法。所述方法利用产伯胺氧化酶的重组菌生产伯胺氧化酶，并用伯胺氧化酶生产4-羟基苯乙醛。

本发明所采用的技术方案是：

一种酶法生产4-羟基苯乙醛的方法，所述方法的具体步骤如下：

(1)构建产伯胺氧化酶的重组菌，发酵获得产伯胺氧化酶的重组菌湿菌体；

(2)单水相转化：配制pH7.0浓度为0.5-1.5g/100ml的酪胺水溶液，加入终浓度为200-400U/ml的过氧化氢酶和终浓度为1-3％(g/100ml)产伯胺氧化酶的重组菌湿菌体进行催化，控制温度28～40℃，通气控制溶氧为5-15％空气饱和度，在自控发酵罐内转化生产4-羟基苯乙醛，反应过程中不断取样测定4-羟基苯乙醛浓度，至4-羟基苯乙醛浓度不再增加反应结束。

进一步，配制pH7.0浓度为0.5-1.5g/100mL的酪胺两相反应体系，所述的两相反应体系为位于容器下层水相和上层的有机溶剂相，有机溶剂为水相的体积的20～60％，再加入终浓度为200-400U/mL过氧化氢酶和终浓度为1-3％(g/100mL)产伯胺氧化酶的重组菌湿菌体进行催化反应。

进一步，所述有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸丁酯中的一种。

进一步，所述产伯胺氧化酶的重组菌的构建方法，所述方法步骤如下：

(1)克隆大肠杆菌K12的伯胺氧化酶基因tynA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将SEQ ID No.1所示核苷酸序列与载体pET28a双酶切并连接，筛选阳性克隆得到重组载体pET28a-tynA；

(3)将重组载体pET28a-tynA转化到宿主菌E.coli BL21(DE3)中，得到产伯胺氧化酶的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-tynA。