[发明专利]一种内源性精原干细胞缺失小鼠模型的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种内源性精原干细胞缺失小鼠模型的制备方法，该制备方法包括如下步骤：ETV5基因编辑工具载体构建；ETV5基因编辑工具载体作用小鼠受精卵；受精卵移植至代孕母鼠子宫；获得ETV5基因敲除纯合子小鼠。通过该方法获得的内源性精原干细胞缺失小鼠可以作为受体模型，通过将外源培养的精原干细胞移植到该受体中，当受体睾丸的微环境中出现外源精原干细胞的定值，甚至产生了外源的精子，这便能充分说明外源精原干细胞培养的成功性。所以该制备方法获得的小鼠模型可以用于检验外源精原干细胞的培养效果。

技术领域

本公开涉及生物技术领域，特别涉及一种内源性精原干细胞缺失小鼠模型的制备方法。

背景技术

精原干细胞(SSCs)是体内唯一能通过自然生殖过程将遗传信息传递给下一代的成体干细胞。它一方面不断自我更新维持自身数量的稳定，一方面通过分化过程逐级形成精原细胞，精母细胞，最终形成有活力的精子。它的生物学特性表现在，SSCs能够进行体外培养、冷冻保存和遗传修饰；能同种或异种移植；可在特定条件下将其诱导去分化成为多能性干细胞，并进一步将这种多能干细胞诱导形成造血细胞、神经元细胞、肌细胞等多种类型细胞等等。

基于它独特的生物学特性，SSCs的应用非常广泛，学者们研究它来阐明精子发生机制；雄性个体不育疾病的治疗与动物种质资源保护；转基因动物生产；体外定向诱导为特定的细胞,再植入受体，修复损伤、治疗疾病；ES(胚胎干细胞)或iPS(诱导多能干细胞)等向其他干细胞生殖细胞的诱导等。

在体外将精原干细胞成功培养，使其能不断增值并长期保持它的干性不会走向分化过程，这是SSCs能广泛应用的研究基础，而鉴定是否成功培养的方法也有很多报道，如碱性磷酸酶染色法、免疫组织(细胞)化学染色法、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测法、流式细胞分析法等，但是这些方法都属于标志物鉴定，这是大部分做精原干细胞培养的文献中所报道过的，由于精原干细胞没有特异性的标志物，前人文献中发掘并报道出来的很多标志物，都是要么在支持细胞，要么在睾丸的其他体细胞中也有表达，即使少有的仅在SSCs中表达，也很难区分是As型精原细胞，还是Apr或者Aal型精原细胞，而只有As型精原细胞是学者们公认的精原干细胞，因为只有As型精原细胞才能成功定值和维持干性。

发明内容

根据本公开的一个方面，提供了内源性精原干细胞缺失小鼠模型的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

ETV5基因编辑工具载体构建；

ETV5基因编辑工具载体作用小鼠受精卵；

受精卵移植至代孕母鼠子宫；

获得ETV5基因敲除纯合子小鼠。

由此，可以获得ETV5基因敲除纯合子小鼠，该小鼠内源性精原干细胞缺失。通过该方法获得的内源性精原干细胞缺失小鼠可以作为受体模型，通过将外源培养的精原干细胞移植到该受体中，当受体睾丸的微环境中出现外源精原干细胞的定值，甚至产生了外源的精子，这便能充分说明外源精原干细胞培养的成功性。所以该制备方法获得的小鼠模型可以用于检验外源精原干细胞的培养效果。

在某些实施方式中，ETV5基因编辑工具载体为包含crispr/cas9系统的表达载体sgRNA-PX330。由此，可以高效的获得内源性精原干细胞缺失小鼠。

在某些实施方式中，ETV5基因编辑工具载体构建，包括如下步骤：

ETV5基因sgRNA靶点序列的设计；

根据sgRNAs序列合成互补配对的单链寡核苷酸，退火形成双链；

退火产物与PX330载体连接；

构建包含crispr/cas9系统的表达载体sgRNA-PX330。