[发明专利]一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法

说明书

本发明提供一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法及其应用，属于禽病学研究领域，采用了引物和内切酶（EcoRV酶），建立能够鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行EcoRV酶酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳条带鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药，建立的方法简单实用、方便快捷、无需进行药敏试验，为在家禽中开展1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药提供快速检测方法，将指导临床科学用药，具有十分重要的研究意义。

技术领域

本发明属于禽病学研究领域，具体涉及一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法及其应用。

背景技术

1型鸭疫里默氏菌可侵害雏鸭、雏鹅、雏火鸡，引起的特征性病变是肝周炎、心包炎和腹膜炎等，俗称传染性浆膜炎。1932年发现，现在仍然在全世界流行，也是危害我国水禽养殖的常见细菌病之一。氟喹诺酮类药物（诺氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星等）属第三代喹诺酮类，由于其抗菌谱广、抗菌活性高、组织穿透性强等特点，广泛应用于治疗家禽的全身性感染，在国内兽医临床的使用量仅次于β内酰胺类抗生素。近年来，1型鸭疫里默氏菌对氟喹诺酮类药物的耐药性多有报道，如何快速测定该细菌对氟喹诺酮类药物的敏感性、指导药物的选择显得非常迫切。细菌对氟喹诺酮类药物耐药的机制有多种，其中DNA促旋酶（氟喹诺酮类药物的作用靶点）的突变是重要原因之一。

前期研究发现，1型鸭疫里默氏菌的DNA促旋酶A亚基基因的喹诺酮类药物耐药决定区（quinolone resistance-determining region, QRDR）第247-249位碱基，如果由AGC突变为ATC，则该细菌对氟喹诺酮类药物肯定耐药。基于此特征，本发明设计一对引物跨过QRDR的该差异性位点，建立PCR方法，对其进行扩增，两类细菌（指对氟喹诺酮类药物耐药或不耐药的1型鸭疫里默氏菌）的PCR扩增产物均为771 bp。由于该扩增区域内核苷酸序列存在EcoRV酶限制性片段长度差异，由AGC突变为ATC会导致该区域的增加一个EcoRV酶位点（GAT↓ATC）。也就是说，该细菌对氟喹诺酮类药物不耐药的菌株（此处为GATAGC）PCR产物可以被EcoRV酶酶切为大小不变（仍然是771 bp）；而该细菌对氟喹诺酮类药物耐药的菌株（此处为GAT↓ATC），其PCR产物PCR产物被EcoRV酶酶切为不同的两段（244 bp和527 bp）。该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行额外EcoRV酶酶切（无需对产物进行胶回收）后再进行电泳，简单实用、无需进行药敏试验、方便快捷，当前尚未见基于类似原理的鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法的报道，本研究可填补相关研究领域空白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，该方法的敏感性和PCR相当，仅仅只需对PCR产物进行EcoRV酶酶切后再进行常规琼脂糖凝胶电泳，即可根据电泳条带鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的引物，所述引物序列如下：

YF1：5’- ATGCATAAAGAAGGAGAAA-3’；

YR1：5’- AATAGCATTACGGTTTCCAA-3’。

一种鉴定1型鸭疫里默氏菌是否对氟喹诺酮类药物耐药的方法，包括以下步骤：

（1）菌株基因组提取；

（2）PCR扩增基因组；

（3）利用EcoRV酶进行PCR产物酶切鉴定。